Газовая хроматография и её применение в фарм анализе

  Рисунок 3 – Схема катарометра

Детектор по теплопроводности (катарометр) представляет собой металлический блок, в полости которого находится тонкая спираль, изготовленная из материала (W, Pt), электрическое сопротивление которого сильно зависит от температуры. Обычно катарометр имеет две ячейки. Через ячейку сравнения пропускают газ-носитель, а через ячейку измерения - элюат. Если спираль омывает чистый газ – носитель, то она теряет постоянное количество теплоты и её температура постоянна. Если же в состав газа – носителя входят определяемые вещества, то его тепло- проводность  уменьшается и соответственно уменьшается температура спирали. Это приводит к изменению сопротивления нити, которое измеряют с помощью моста Уитстона. 

            Рисунок 4 - Мост Уитстона для катарометра

При использовании катарометра в хроматографе должны быть две колонки, через одну пропускают газовую смесь, содержащую разделяемые вещества, а через вторую - чистый газ-носитель.

Следует отметить, что в качестве газа – носителя можно использовать только водород и гелий, теплопроводность которых примерно в 6-10 раз выше, чем у органических веществ. Катарометр не годится в качестве детектора для капиллярной газовой хроматографии из–за его низкой чувствительности.  

Пламенно-ионизационный детектор (ПИД) представляет собой металлическую камеру, в корпус которой снизу введена горелка, выполняющая функцию катода, а сверху – собирающий электрод (анод).    Для работы данного детектора необходимы водород, который смешивается с элюатом и сгорает при выходе из горелки, и воздух  - для обеспечения горения водорода.

Рисунок 5 – Схема ПИД: 1 - собирающий электрод; 2 - горелка

 

Пламя чистого водорода практически не содержит ионов, поэтому фоновое сопротивление пространства между электродами очень велико, а сила тока очень мала. Если в пламя из колонки попадает органическое вещество, то оно ионизируется. Ионы заполняют межэлектродное пространство, в результате чего сопротивление снижается, а сила тока резко увеличивается.

 ПИД хазактеризуется очень низким пределом обнаружения и большим линейным диапазоном, что делает его весьма удобным при определении следов. Однако при детектировании происходит компонентов пробы (деструктивный характер).

Термоионный детектор внешне похож на пламенно-ионизационный. Он имеет кварцевую горелку, на конце которой находится таблетка из соли щелочного металла (например, CsBr или Rb2SO4). При нагревании эта соль испаряется и в газовой фазе устанавливается равновесие:

CsBr  + H+  =  Cs+  + HBr

При попадании в пламя соединения, содержащего в составе молекулы атомы фосфора и некоторые другие гетероатомы, скорость образования ионов резко увеличивается и сила тока возрастает. Термоионный детектор наиболее чувствителен к фосфорсодержащим соединениям. В меньшей степени он реагирует на соединения азота, серы, галогенов (кроме фтора), мышьяка, олова.

Детектор электронного захвата (ДЭЗ) представляет собой ионизационную камеру (ячейку с двумя электродами), в которой находится источник b-излучения, например, 63Ni или титановая фольга, содержащая адсорбированный тритий. В качестве газа-носителя при работе с детектором электронного захвата применяют азот, гелий, аргон и другие газы, способные ионизироваться с освобождением электрона. Фоновый ток детектора обусловлен, в основном, электронами. Молекулы анализируемых веществ, обладающие большим сродством к электрону, при попадании в детектор захватывают электроны и превращаются в анионы. Число носителей заряда при этом не изменяется, но сила тока уменьшается, так как анионы обладают на несколько порядков меньшей подвижностью, чем свободные электроны. Кроме того, образовавшиеся анионы вступают во взаимодействие с катионами газа-носителя, что вносит дополнительный вклад в уменьшение силы тока.

                                       Рисунок 6 -  Схема ДЭЗ

 

3. Особенности  газотвёрдофазной хроматографии

Особенность метода газоадсорбционной хроматографии (ГАХ) в том, что в качестве неподвижной фазы применяют адсорбенты с высокой удельной поверхностью (10—1000 м2/г)) и распределение веществ между неподвижной и подвижной фазами определяется процессом адсорбции. Адсорбция молекул из газовой фазы, т.е. концентрирование их на поверхности раздела твердой и газообразной фаз, происходит за счет межмолекулярных взаимодействий (дисперсионных, ориентационных, индукционных), имеющих электростатическую природу. Возможно образование водородной связи, причем вклад этого вида взаимодействия в удерживаемые объемы значительно уменьшается с ростом температуры.

Для аналитической практики важно, чтобы при постоянной температуре количество адсорбированного вещества на поверхности cs было пропорционально концентрации этого вещества в газовой фазе сm:

Cs =  kСm

т.е. чтобы распределение происходило в соответствии с линейной изотермой адсорбции (k — константа). В этом случае каждый компонент перемещается вдоль колонки с постоянной скоростью, не зависящей от его концентрации. Разделение же веществ обусловлено различной скоростью их перемещения. Поэтому в ГАХ чрезвычайно важен выбор сорбента, площадь и природа которого обусловливает разделение при заданной температуре.

В качестве НФ для ГАХ используют как неорганические  (активные  угли, силикагели, оксид алюминия), так и органические (сополимеры стирола и дивинилбензола) сорбенты.

К преимуществам ГАХ относят:

• широкий температурный диапазон
• быстрое установление равновесия
• хорошая стабильность базовой линии, что особенно важно для ГХ с программируемой температурой и для сочетания ГХ и МС.

Наряду с преимуществами у ГАХ имеются также существенные недостатки:

• малый линейный интервал изотермы адсорбции (вследствие этого                                      возникают ассиметричные пики)
• высокие энальпии адсорбции, приводящие к большому времени анализа
• поверхность некоторых сорбентов обладает каталитической активностью.

 

 

4. Особенности  газожидкостной хроматографии

В основе механизма разделения определяемых компонентов в методе ГЖХ лежит их распределение между неподвижной жидкой фазой  и газом – носителем.

К жидкостям, используемым в качестве НФ, предъявляются следующие требования:

• термическая и химическая устойчивость
• нелетучесть (tкип НФ должна быть примерно на 100°С выше требуемой температуры колонки)
• селективность (разделяющая жидкость должна обеспечивать различные коэффициенты распределения для анализируемых компонентов)
• небольшая вязкость (в противном случае замедляется процесс диффузии)
• образование равномерной плёнки, прочно связанной с носителем
• В зависимости от полярности различают жидкие фазы трёх типов:
• неполярные (УВ, метилсилоксаны)
• умеренно полярные (сложные эфиры, нитрилы, фенилсилоксаны)
• полярные (полигликоли, нитросилоксаны)

Среди неподвижных фаз особое место занимают химически связанные фазы. Они обладают более высокой термостабильностью и не десорбируются с колонки, поскольку разделяющая жидкость ковалентно связана с поверхностью материала носителя. 

Зная свойства неподвижной жидкой фазы и природу разделяемых веществ, например класс, строение, можно достаточно быстро подобрать подходящую для разделения данной смеси селективную жидкую фазу. При выборе разделяющей жидкости пользуются эмпирическим правилом “ Подобное растворяется в подобном “. Так, например, по отношению к полярным соединениям (спирты, органические кислоты, амины) высокой селективностью обладают типичные полярные фазы, содержащие в своём составе функциональные группы – ОН, - СN, - СООН. Напротив, для разделения неполярных соединений (насыщенные УВ, галогенированные УВ) отлично подходят неполярные фазы.

К твёрдым носителям, на которые наносятся неподвижные фазы, предъявляются следующие требования:  

 Твердый носитель должен:

• однородность
• термическая и механическая устойчивость
• химическая инертность
• сферическая форма частиц,  небольшая удельная поверхность

Для нанесения жидкой фазы на твёрдый носитель её смешивают с легколетучим растворителем, например, эфиром. К этому раствору добавляют твёрдый носитель. Смесь нагревают, растворитель испаряется и жидкая фаза остаётся на носителе.

Наибольшее распространение из носителей в ГЖХ получили носители на основе диатомита – микроаморфного, содержащего воду, диоксида кремния (хромосорб G, хромосорб W, хроматрон Н). Необработанные специальным образом носители содержат на своей поверхности металлы и силанольные группы. Это приводит к физической адсорбции полярных соединений, в результате чего на хроматограмме появляются пики с размытым задним фронтом. Для предотвращения нежелательных взаимодействий носители обрабатывают кислотой (для удаления металлов) и диметилдихлорсиланом (DMCS) – для превращения силанольных групп на поверхности в силильные эфиры:

Рисунок 7 – Инактивация остаточных силанольных групп

 

Полученный таким образом носитель обозначают AW-DMCS – промытый кислотой и обработанный диметилдихлорсиланом.

В некоторых случаях в качестве носителей используют полимерные носители (тефлон), стеклянные шарики, графитированную сажу.

 

 

5. Практическое  применение

В газовой хроматографии, для того чтобы учесть влияние объёма и температуры, для идентификации определяемых веществ вместо времени удерживания используют объём удерживания. Общий объём удерживания VR и объём удерживания подвижной фазы (мёртвый объём) VM получают умножением соответствующих времён удерживания на объёмную скорость потока газа – носителя  F:

 

VR = FtR   и    VM = FtM

 

При сравнении хроматограмм, полученных на разных приборах, во избежание ошибок в идентификации используют исправленный объём удерживания VR’ , равный разности между общим и мёртвым объёмами удерживания:

 

VR’ = VR – VM

 

Часто идентификацию проводят по относительным параметрам удерживания, которым относятся относительный объём удерживания, а также различные индексы удерживания  (Ковача, Роршнайдера, Мак-Рейнольдса).

Относительный объём удерживания равен отношению объёма удерживания определяемого компонента к объёму удерживания стандарта:

 

Vотн = VR/VR.st

 

Эта величина зависит только от состава подвижной и неподвижной фаз.

Однако табулирование значений Vотн с целью идентификации вызывает сложности из-за выбора стандарта. Попытки выбрать один стандарт (в газовой хроматографии рекомендовали, например, н-нонан) приводят к трудностям, поскольку всегда желательно, чтобы приведенные объемы удерживания определяемого вещества и стандарта были близкими, добиться же этого при едином стандарте невозможно. Легкокипящие вещества элюируются значительно быстрее нонана и даже бывает трудно получить его пик за приемлемое время при температурах, близких к комнатной; наоборот, при анализе высококипящих веществ нонан элюируется слишком быстро и точность измерения VR.st оказывается очень низкой. Поэтому в газовой хроматографии для целей идентификации применяют, как правило, интерполяционные характеристики и, прежде всего, индекс удерживания I. 

Индекс удерживания I (индекс Ковача) соединения равен 100-кратному числу атомов углерода гипотетического н-алкана с таким же временем удерживания, как и у определяемого соединения.

Согласно этому определению н-алканы имеют индекс, равный 100-кратному числу атомов углерода в молекуле при любых температурах на всех разделяющих колонках. Например, для н-гексана он равен 600, для н-октана  - 800.

Для определения индекса удерживания определяемое вещество хроматографируют в смеси, которая содержит по крайней мере два н-алкана. При этом время удерживания определяемого вещества должно находится между временами н-алканов:

 

                   Рисунок 8 - Определение индекса удерживания Ковача

                                                                                                                                                                                                              Расчёт индекса проводится по следующей формуле:

 

 

 где, tRx, tRz, tR(z+1) – времена удерживания определяемого вещества Х, н-алкана с числом углеродных атомов Z и н-алкана с числом углеродных атомов Z+1.

Индексы удерживания определены для многих соединений и доступны в виде табличных данных для большинства обычных неподвижных фаз. Они относительно независимы от температуры.