ДНК-оригами: как из ДНК делают интересные штуки нанометрового размера

ДНК-оригами: как из ДНК делают интересные штуки нанометрового размера

Нещодавно я виявив вельми сумний факт: на Хабре абсолютно не освітлена така кумедна тема , як ДНК - орігамі. Є тільки один пост 2009 року, що розповідає лише самий початок цікавої історії про те , як з ДНК (так- так, тієї самої дезоксирибонуклеїнової кислоти , несучої нашу генетичну інформацію) можна створювати всякі хитрі , плоскі і тривимірні штуки нанометрового розміру. Та сама нано- технологія , як вона є. У цьому огляді я хочу розповісти про розвиток ДНК - орігамі : двомірні смайлики з ДНК , тривимірні фігури , кристали з ДНК із запрограмованою структурою , ДНК - «коробочки» з кришкою , здатні нести молекули потрібних речовин і випускати їх після сигналу про відкриття кришки, і , нарешті , динамічні структури типу ДНК - крокоходом ( walker ) , що гуляє по підкладці ( творці гордо кажуть , що це вже наноробот !) . Хто хоче дізнатися більше про те , навіщо все це потрібно , почитати про технології виготовлення красивих нанометрових штук з ДНК або просто подивитися красиві картинки , ласкаво просимо під кат.

 
 
Так виглядає ДНК-наноробот 
 
трохи теорії 
 
Наприкінці двадцятого - початку двадцять першого століття постало питання про конструювання об'єктів нанометрового розміру. Для чого ? Загальний вектор на мініатюризацію існує досить давно , причому історично це завжди був рух « зверху вниз » - наприклад , в 70 -х роках при виготовленні мікросхем мінімальний контрольований розмір становив 2-8 мкм , далі це значення стрімко зменшувалася і зараз в серійному виробництві знаходяться чіпи , виконані по 22 -нм технологічному процесу. Тут у думаючих людей виникло питання : а чи не можна рухатися «знизу вгору» ? Чи не можна змусити атоми і молекули збиратися в потрібні структури і потім ці структури використовувати в техніці? Очевидні вимоги до такої « самозборки » системі : матеріали для неї повинні бути досить дешевими і доступними , самосборка складної просторової структури системи повинна легко і очевидно « програмуватися » , система повинна бути здатна нести корисний функціонал. Тут же пригадали, що в природі такі самозборні системи вже існують і чудово працюють - це макромолекули всіх живих організмів , наприклад , білки. Тут приходить і перше разочарування - білки занадто складно влаштовані , їх тривимірна структура задається абсолютно неочевидним чином безліччю нековалентних взаємодій і отримати білок з довільною структурою - досі абсолютно нетривіальна і нерозв'язна задача. Тобто використовувати білки для конструювання потрібних об'єктів нано- розмірів технічно неможливо. Що ж робити ? Виявляється , є й інші макромолекули , чия структура влаштована набагато простіше структури білків. 
 
У 1953 році Уотсон і Крик опублікували свою модель структури ДНК , що опинилася абсолютно вірною. ДНК ( дезоксирибонуклеїнова кислота) - це цікаво влаштований лінійний полімер. Одна нитка ДНК складається з монотонно повторюваного цукрово- фосфатного остову (він асиметричний і має напрямок , розрізняють 5 ' і 3 ' кінець ланцюга ) , проте до кожного цукру ( дезоксирибози у разі ДНК) прикріплений один з чотирьох нуклеотидів (синонім слова нуклеотид - « основа » ) - аденін , або тимін , або цитозин , або гуанін . Зазвичай їх позначають однією буквою - А , Т , Ц , Г. Таким чином , в ДНК є тільки 4 типи мономерів , на відміну від 20 амінокислот у складі білка , що робить структуру ДНК набагато простіше. Далі стає ще веселіше - є так зване « Уотсон- Кріковських спаровування основ» : аденін може специфічно зв'язуватися з тиміном , а гуанін - з цитозином , утворюючи пари А -Т і Г -Ц (і ще Т- А і Ц -Г , зрозуміло ), інші взаємодій між нуклеотидами в спрощеному випадку можна вважати неможливими ( вони можливі у вигляді винятку при деяких рідкісних умовах , але для нас це не важливо). Уотсон- Кріковські спаровування основ ще називаєть комплементарністью .

 
 
Два ланцюга ДНК, послідовність основ яких комплементарна, негайно «злипаються» в подвійну спіраль. Виникає питання: а що, якщо на одному ланцюзі ДНК знаходяться дві комплементарні області? Відповідь: ланцюг ДНК може зігнутися і комплементарні області зможуть утворити подвійну спіраль, а разом з місцем вигину ця структура називатиметься «шпилькою» (DNA hairpin):

 
 
На чому ж грунтується « злипання » двох комплементарних ланцюгів ДНК (або , аналогічно , двох комплементарних ділянок одного ланцюга ) ? Ця взаємодія тримається на водневих зв'язках. Пара А -Т з'єднується двома водневими зв'язками , пара Г- Ц - трьома , тому ця пара більш енергетично стійка. Про водневі зв'язки треба розуміти наступне : енергія одного водневої зв'язку ( 5 ккал / моль) не набагато перевершує енергію теплового руху , а значить , один окремо взятий водневий зв'язок може бути з високою ймовірністю тепловим рухом зруйнований. Однак , чим більше водневих зв'язків, тим більш стійкою стає система . Це означає , що короткі ділянки комплементарних основ ДНК не можуть утворити стійку подвійну спіраль , вона буде легко « плавитися » , однак більш довгі комплементарні ділянки вже зможуть утворити стабільні структури . Стабільність двохланцюгової структури виражається одним параметром - температурою плавлення ( Тм , melting temperature ) . За визначенням , температура плавлення - це температура , при якій в рівновазі 50 % молекул ДНК з даною довжиною і послідовністю нуклеотидів знаходяться в двохланцюговому стані , а інші 50 % - в розплавленому одноланцюговому стані. Очевидно , що температура плавлення безпосередньо залежить від довжини комплементарної області (чим довше - тим вище температура плавлення ) і від нуклеотидного складу ( так як в парі Г -Ц три водневі зв'язки , а в парі А -Т - дві , то чим більше пар Г -Ц , тим вище температура плавлення ) . Температура плавлення для даної послідовності ДНК легко вираховується по емпірично виведеній формулі . 
Від теорії до практики 
 
Отже , теорію ми вивчили . Що ж ми можемо зробити на практиці? За допомогою хімічного синтезу ми можемо прямо синтезувати ланцюга ДНК довжиною до 120 нуклеотидів ( просто потім вихід продукту різко падає). Якщо ж нам потрібна більш довгий ланцюг , то її без проблем можна зібрати з тих самих хімічно синтезованих фрагментів довжиною до 120 нуклеотидів (наприклад , дядечко Крейг Вентер відзначився тим , що зі шматочків зібрав ДНК завдовжки аж 1,08 мільйона пар основ). Тобто в 21 столітті ми можемо легко і дешево робити ДНК будь-якій послідовності , який тільки захочемо. А хочемо ми , щоб потім ДНК згорталася у всякі хитрі і складні структури , які ми потім зможемо використовувати. Для цього у нас є принцип комплементарності - як тільки в послідовності ДНК з'являються комплементарні зони , вони злипаються і утворюють дволанцюжкову ділянку. Очевидно , ми хочемо робити структури , стабільні при кімнатній температурі , значить ми хочемо розрахувати температуру плавлення для даних ділянок і зробити її досить великий . При цьому на одному ланцюжку ДНК ми можемо робити багато різних областей з різними послідовностями і злипатися будуть тільки комплементарні . Так як комплементарних областей може бути декілька , в результаті молекула може згорнутися досить складним чином !

Якось так , наприклад : 
 
 
Так само , крім позитивного дизайну (створення областей , здатних утворювати потрібну нам структуру) , при розробці структур з самозборкою не можна забувати і про негативний дизайн - потрібно перевіряти отриману послідовність ДНК на потенційну наявність паразитних взаємодій ( коли частини створених нами областей виявляються здатними взаємодіяли по- іншого, утворюючи непотрібні нам паразитні структури) і від цих паразитних структур і взаємодій позбавлятися , змінюючи нуклеотидну послідовність ДНК. Як отримати найпростіші структури ДНК типу «шпильки » досить очевидно , але нудно і нецікаво . Чи можна з ДНК зробити щось складніше ? Тут вже без комп'ютерних обчислень не обійтися. Ми хочемо якусь структуру і тепер повинні підібрати послідовність ДНК , яка в цю структуру згорнеться за рахунок взаємодії комплементарних областей , але при цьому в послідовності не повинно бути паразитних взаємодій , непередбачених нами комплементарних областей , що утворюють альтернативні структури . Плюс структура повинна відповідати іншим критеріям , наприклад , мати температуру плавлення вище деякої заданої величини. В результаті маємо типову оптимізаційну задачу . 
Двомірні структури з ДНК 
 
Методологічний прорив влаштував Paul Rothemund ( Каліфорнійський Технологічний Інститут ) у 2006 році , саме він і придумав термін « ДНК - орігамі ». У своїй статті в « Nature » він представив безліч кумедних двомірних об'єктів , зроблених з ДНК. Принцип , запропонований ним , досить простий : взяти довгу ( приблизно 7000 нуклеотидів ) « опорну » одноланцюжкову молекулу ДНК і потім за допомогою сотні коротких ДНК - скріпок , що утворюють дволанцюжкові області з опорною молекулою , зігнути опорну ДНК в потрібну нам двомірну структуру. Ось малюнок з оригінальної статті , що представляє всі стадії розробки. Для початку ( а ) намалюємо потрібну нам форму червоним кольором і прикинемо , як заповнити її ДНК ( представимо її на цьому етапі у вигляді труб). Далі ( b ) представимо , як провести одну довгу опорну молекулу по потрібній нам формі (показана чорною лінією ) . На третьому етапі ( с) подумаємо , де ми хочемо розмістити « скріпки » , стабілізуючі укладку довгою опорної ланцюга. Четвертий етап ( d ) : більше деталей , прикидаємо , як виглядатиме вся потрібна нам структура ДНК і, нарешті , ( e ) ми маємо схему потрібної нам структури , можна замовляти ДНК потрібної послідовності! 
 
 
Як же з хімічно синтезованих ДНК зібрати потрібну нам структуру? Тут на допомогу приходить процес плавлення. Ми беремо пробірку з водним розчином , кидаємо в неї всі фрагменти ДНК і нагріваємо до 94 - 98с , температури , яка гарантовано плавить всю ДНК ( переводить її в одноланцюжкову форму). Далі ми просто дуже повільно (на протязі багатьох годин , в деяких роботах - на протязі декількох днів) охолоджуємо пробірку до кімнатної температури ( ця процедура називається « відпал » , annealing ) . При цьому повільному охолодженні , коли температура виявляється досить низькою , поступово утворюються потрібні нам дволанцюжкові структури . В оригінальній роботі в кожному експерименті приблизно 70 % молекул успішно збиралися в потрібну структуру , решта мали дефекти . 
 
Далі, після того , як структура розрахована , непогано б довести , що вона збирається саме так , як нам треба. Для цього найчастіше використовують атомно- силову мікроскопію , яка якраз прекрасно показує загальну форму молекул , але іноді використовують і cryo -EM (електронну мікроскопію ) . Автор зробив безліч веселих форм з ДНК , на картинках представлені розрахункові структури і результат експериментального визначення структур за допомогою атомно -силової мікроскопії. Насолоджуйтесь !

Тривимірні структури з ДНК 
 
Після того , як розібралися з конструюванням складних плоских об'єктів , чому б не перейти до третього виміру ? Тут піонерами була група хлопців з Інституту Скріппса в Ла -Холі , Каліфорнія , які в 2004 році придумали , як з ДНК зробити нано- октаедр . Хоча ця робота і зроблена на 2 роки раніше плоского ДНК - орігамі , в той раз було вирішене лише окремий випадок (отримання октаедра з ДНК) , а в роботі по ДНК - орігамі було запропоновано загальне рішення , тому саме робота 2006 року по ДНК - орігамі вважається основоположною. 
 
Октаедр був зроблений з одноланцюжкової молекули ДНК довжиною приблизно 1700 нуклеотидів , що має комплементарні області і до того ж скріплених п'ятьма 40 - нуклеотидними ДНК - адаптерами , в результаті був отриманий октаедр з діаметром 22 нанометра . 
На малюнку зверніть увагу на колірне кодування на двомірній розгортці октаедра. Бачите області , відмічені однаковим кольором ? Вони містять як комплементарні зони (паралельні ділянки з'єднані поперечними зв'язками ) , так і некомплементарні (на схемі вони зображені у вигляді бульбашок ) , при цьому зони одного кольору , розташовані в різних частинах двомірної розгортки , взаємодіють один з одним , утворюючи складну структуру , зображену на малюнку 1с і утворить грань тривимірного тетраедра . Насолоджуйтесь красивими картинками !

 
 
 
У 2009 році вчені з Бостона і Гарвардського Університету опублікували принципи побудови тривимірного ДНК - орігамі , як вони самі кажуть , за подобою бджолиних сот. Одне з досягнень цієї роботи - люди написали open - source програму caDNAno для конструювання тривимірних структур ДНК ( вона працює на Autodesk Maya ) . З цією програмою навіть неспеціаліст може зібрати потрібну структуру з готових блоків з використанням простенького графічного інтерфейсу , а програма розрахує необхідну послідовність (або послідовності) ДНК , в цю структуру згортається.

 
 
 
 
У наступній своїй роботі вони навчилися робити з ДНК складні тривимірні об'єкти з контрольованим викривленням і порадували читачів журналу «Science» красивими картинками різних викривлених об'єктів з ДНК (там такі класні шестерінки вийшли!). 
 
 

періодичні структури 
 
До цих пір вчені гралися з неперіодичними структурами з ДНК. А що якщо зробити таку структуру , щоб один блок міг взаємодіяти з іншим таким же блоком , і так до нескінченності ? Уявіть собі три відрізки , розташованих під кутом 90 градусів один до одного ( походить на протитанковий їжак ) . Очевидно , що така структура може бути вузлом нескінченної кубічної решітки , якщо кожна сторона такого їжака буде взаємодіяти з іншим таким їжаком . Саме цю ідею в 2010 році втілили на практиці вчені з Нью -Йорка , вони зробили такого ДНК - їжака , який негайно сформував тривимірну грати , тобто кристал з ДНК , так що вони використовували рентгеноструктурний аналіз , щоб показати , що ДНК утворили саме таку структуру , яку вони і хотіли. У свою чергу , так як кристали ДНК мали розмір до пів- міліметра (а це вже макро- об'єкт ) , було гордо заявлено , що тепер з нано- об'єктів ми вміємо збирати макро -об'єкти . 
 
 
Ось стерео-картинка вузла решітки, на нижній картинці з електронною густиною ДНК чітко видно два вузли-«противотанкового їжака»): 
 

динамічні структури 
 
Наступний крок у конструюванні тривимірних нано- об'єктів так само очевидний - а що якщо змусити це все якось рухатися? Рухомий об'єкт вже можна і нано- роботом назвати. Самий простенький ДНК - крокохід був зроблений в 2008 році командою з Каліфорнійського Технологічного інституту . Працює він за досить простим принципом . Уявіть собі одноланцюжкову ДНК довжиною , скажімо , 100 нуклеотидів. Уявіть іншу одноланцюжкову ДНК , коротку , довжиною 50 нуклеотидів , комплементарних половині першого молекули. Що буде , якщо їх змішати ? Правильно , вони утворюють двухланцюжкову структуру в районі цих 50 нуклеотидів , друга ж половина першої молекули залишиться вільною. А що якщо до цієї структури додати ще одну молекулу ДНК , довжиною 100 нуклеотидів і повністю комплементарної першій молекулі ? Відповідь цілком очевидна : вона витіснить короткий ланцюг довжиною 50 нуклеотидів , оскільки володіє більшою спорідненістю до першої молекули (у них спорідненість 100 з 100, а з короткою - лише 50 з 100 нуклеотидів ) . Саме так і працював першим ДНК - крокохід . На підкладці закріплені молекули одноланцюжкової ДНК , до них з розчину приходить молекула - крокохід , що має комплементарні зони до двох сусідніх ланцюгів на підкладці і зв'язується з ними. Якщо потім ми додамо в розчин іншу ДНК , що має більшу спорідненість до першого ланцюга на підкладці , то вона витіснить одну ногу крокоходу , після чого ця нога зв'яжеться з наступним ( третім ) ланцюгом ДНК на підкладці. Додаючи нові фрагменти ДНК можна гнати крокохід все далі і далі по підкладці. Зворотний хід неможливий , так як попередні ланцюги на підкладці вже інактивовані зв'язуванням з довшою молекулою ДНК. 
 
 
 
Хоча перший крокохід виглядав настільки примітивно , конструкція була доопрацьована вченими з Нью -Йорка. Вони зробили більш складний крокохід з кількома « руками» і « ногами » , причепили за допомогою комплементарних ДНК на підкладку «вантаж» (золоті частинки діаметром 5 і 10 нм ) і « запрограмували » крокохід таким чином , щоб він пройшов по підкладці і зібрав вантаж - три маленькі і одну велику золоті частинки. Послідовність кроків легко відстежити по стрілочках , а на експериментальній картинці справа видно частинки золота і як крокохід їх збирає . Нано -робот в дії! На нижній картинці показано , як саме відбувається процес « крокування » та збору вантажу , принцип - той же самий , витіснення однієї ДНК іншою. 
 
 
 
 
Але це ще не все. Вінцем ДНК - робототехніки (думаю , тут в моєму голосі чуємо деякий сарказм ) став « наноробот для молекулярного транспорту » , як охрестили його творці з Бостона . Фактично хлопці зробили якусь « коробочку » з ДНК , що закривається на « замок» з ДНК , який може бути відкритий за вже відомим нам принципу витіснення однієї ДНК другою , як в крокохода . Всередині коробочки захований вантаж - частинки золота або молекули імуноглобуліну. ДНК можна хімічно модифікувати таким чином , щоб на ній можна було закріпити цей самий вантаж . Отже, ми маємо закриту коробочку , вміст коробочки надійно схований. Тут ми додаємо молекулу , що відкриває коробочку , вона відкривається і імуноглобулін , захований всередині , виходить назовні і починає діяти! Ми ж плескати в долоні , розчулюємося і радіємо прогресу. 
 
 
Хлопці навіть не полінувалися зробити демонстрацію proof of principle на живих ракових клітинах : вони ховали в коробочку антитіла , що блокують ключові білки клітинного циклу , вводили коробочки в ракові клітини і після додавання активатора що відкриває коробочку ракові клітини правда переставали ділитися! Таким чином була показана принципова можливість використання таких конструкцій для спрямованої доставки ліків в організмі і їх виділення в потрібний час за сигналом від молекули - активатора . Одна залишилася проблема , як ракову клітину від здорової надійно відрізнити ... 
Для чого козі баян ? 
 
Все це , звичайно , здорово і добре , картинки красиві , але уважний читач може запитати : «А де обіцяна на самому початку користь для народного господарства ? ». Як і з усякою новою технологією , поки великої практичної користі дійсно немає , крім естетичного задоволення від споглядання цієї нано- краси. Однак , все тільки починається! По-перше , ДНК може бути хімічно модифікована, до неї можуть бути додані хімічні групи, які забезпечують зв'язування з іншими молекулами і тоді ДНК можна використовувати як підкладку для побудови складних структур з інших молекул. Наприклад, зараз всі хочуть щось майструвати з нанотрубок. Якщо вдасться зробити адаптер , що зв'язується одним кінцем з ДНК , а іншим - з нанотрубкою , тоді структури з ДНК можна використовувати для з'єднання нанотрубок. З іншого боку , вже є повідомлення про контрольовану металізації ДНК , а звідси вже рукою подати до конструювання електронних пристроїв на базі структур з металізованої ДНК. Може, вчені винайдуть більш відповідний полімер , що забезпечує більш зручну самозборку складних структур , але в кожному разі ДНК - орігамі займе своє місце в історії науки , як один з перших прикладів конструювання складних об'єктів в нано- масштабі. Як би то не було , нас чекає велике і світле майбутнє , чого і вам бажаю! 
 
PS: цікаве доповнення від vxsw : 
«Вже пару років проводиться конкурс BIOMOD по дизайну таких штук за підтримки Wyss Institute ( поміченого в багатьох цікавих біотехнологічних досягненнях начебто недавньої 3D-друку міні- акумуляторів). » 
 
PPS : в личке запитали, чому ДНК , а не РНК. Відповідь така : я бачу дві основні причини : ( 1 ) ДНК - хімічно більш стабільна. Всі живі організми синтезують величезну кількості РНКаз , ферментів , що знищують РНК. Якщо Ви випадково залізете голим пальцем в пробірку з РНК , від РНК нічого не залишиться - все зжеруть РНКази . Тому з РНК працюють у спеціальних приміщеннях і тд - мороки набагато більше , ніж при роботі з ДНК. З ДНК таких проблем немає , палець в пробірку сунеш - нічого ДНК не буде. ( 2 ) Вартість хімічного синтезу РНК в рази перевищує вартість синтезу ДНК. Думаю , тому народ і розважається з ДНК - дешевше і простіше.