Анализ азитромицина методом капиллярного электрофореза

ФЕДЕРАЛЬНОЕ ГОСУДАРСТВЕННОЕ  АВТОНОМНОЕ ОБРАЗОВАТЕЛЬНОЕ УЧРЕЖДЕНИЕ ВЫСШЕГО ПРОФЕССИОНАЛЬНОГО ОБРАЗОВАНИЯ

БЕЛГОРОДСКИЙ ГОСУДАРСТВЕННЫЙ  НАЦИОНАЛЬНЫЙ ИССЛЕДОВАТЕЛЬСКИЙ УНИВЕРСИТЕТ

(НИУ «БелГУ»)

 

 

фармацевтический факультет

Кафедра фармацевтической химии и фармакогнозии

 

 

 

АНАЛИЗ АЗИТРОМИЦИНА МЕТОДОМ КАПИЛЛЯРНОГО ЭЛЕКТРОФОРЕЗА

Курсовая работа

студента дневного отделения 4 курса группы 200801

Беляева Кирилла Александровича

 

 

 

Научный руководитель:

Ассистент Г.В. Васильев

 

 

 

 

 

 

 

БЕЛГОРОД 2012

 

Содержание

 

Введение…………………………………………………………………………..3

 

Капиллярный элетрофорез……………………………….......………………….4

 

Капиллярный электрофорез в  фармацевтическом анализе…………………...13

 

Анализ азитромицина (Сумамед ©) методом капиллярного электрофореза..17

 

Вывод……………………………………………………………………….…….22

 

Список использованной литературы……………………………………..…….23

 

 

 

 

 

 

 

Введение

 

Метод капиллярного электрофореза является одним из наиболее точных физико-химических методов и динамично развивается в настоящее время. Он сочетает в себе такие достоинства как экспрессность, универсальность, широкую возможность автоматизации анализа, высокую эффективность, экономичность одного анализа.

В настоящее  время капиллярный электрофорез не является фармакопейным методом  в РФ. Это накладывает весомые  ограничения на его использование в фармацевтическом анализе.

Анализ антибиотиков физико-химическими методами имеет  ряд преимуществ. В настоящее  время он проводится как правило с использованием систем ВЭЖХ. В данной работе изучалась возможность применения методов капиллярного электрофореза в анализе макролидов, в частности азитромицина (Сумамед ©).

Целью данного  исследования стало разработка методики анализа азитромицина на системе капиллярного электрофореза.

Для реализации цели были поставлены следующие задачи:

- провести литературный обзор по теоретическим основам капиллярного электрофореза;

- рассмотреть  литературные данные по использованию  капиллярного электрофореза в  фармацевтическом анализе;

- разработать методику анализа азитромицина с помощью системы капиллярного электрофореза.

 

 

 

 

 

Капиллярный электрофорез

 

Метод капиллярного электрофореза стал популярным в  начале 1980-х годов благодаря работам Iorgenson и Lucas, которые продемонстрировали, что эффективность электрофореза многократно увеличивается при его проведении в кварцевых капиллярах. Эти исследования непосредственно способствовали разработке инструментального обеспечения метода. Раннее метод электрофореза из-за громоздкости и невысокой эффективности применялся в ограниченном объёме для анализа макромолекул. Введение капиллярного формата сделало возможным проводить полное количественное и автоматизированное определение не только больших молекул, но и малых (вплоть до неорганических ионов) [12].

Элетрофорезом называется движение заряженных частиц с различной скоростью в растворе электролита под влиянием электрического поля. Катионы мигрируют по направлению к отрицательно заряженному электроду (катоду), а анионы притягиваются к положительно заряженному электроду (аноду).

В случае классического  электрофореза применяются гели или полоски бумаги, пропитанные электролитами, для того чтобы уменьшить помехи, вызванные конвенкцией. Использование полиакриламидного гель-электрофореза (ПААГ-электрофореза) позволяет проводить эффективное разделение молекул ДНК и белков.

Быстрое развитие метода капиллярного электрофореза было обусловлено двумя решающими усовершенствованиями: во-первых, был существенно уменьшен внутренний диаметр капилляра; во вторых, детектирование по электропроводности, пришедшее первоначально из изотахифореза, было заменено прямым УФ-детектированием в потоке жидкости. Дальнейшее развитие метода стало возможным при использовании кварцевого капилляра с высокой прозрачностью в ближней УФ-области и равномерным внутренним диаметром от 25 до 100 мкм. При этом улучшилось как разделение, так и детектирование. Применение кварцевого капилляра позволило использовать модифицированный ВЭЖХ-детектор для определения разделяемых веществ непосредственно в капилляре. Разделение смесей происходит на капиллярных колонках длинной от 20 до 80 см.

Капиллярный электрофорез, являясь относительно молодым методом разделения и анализа, поначалу заимствовал большую часть терминов из наиболее близкого сепарационного метода — ВЭЖХ. Со временем, учитывая основной принцип разделения в КЭ — электромиграционный, была сформирована собственная терминологическая база метода капиллярного электрофореза, которая с 2002 г. рекомендована к использованию ИЮПАК [1].

 

Рисунок 1. Система капиллярного электрофореза.

 

Время миграции, t_м (migration time, t_m) — время, необходимое компоненту для прохождения им эффективной длины капилляра (L_эфф, L_eff) от зоны ввода пробы (начала капилляра) до зоны детектирования.

Электроосмотический поток, ЭОП (electroosmotic flow, EOF) — течение жидкости в капилляре под действием приложенного электрического поля. Время, необходимое жидкости для преодоления эффективной длины капилляра вследствие возникающего ЭОП, называют временем ЭОП (t_эоп, t_eof) и экспериментально определяют из электрофореграммы (electropherogram) по времени миграции нейтрального компонента — маркера ЭОП.

Подвижность ЭОП, μ_эоп (electroosmotic mobility, μ_eof) — представляет собой отношение скорости ЭОП к напряженности электрического поля. Скорость ЭОП (electroosmotic velocity, v_eof) положительна при направлении движения жидкости от входного участка капилляра к детектору и отрицательна при обратном направлении. Скорость ЭОП вычисляют как: v_эоп = L_эфф/t_эоп. Напряженность электрического поля представляет собой отношение приложенной разности потенциалов (U) к общей длине капилляра (L_общ, L_tot). Таким образом, подвижность ЭОП вычисляют из экспериментальных данных: μ_эоп = L_общ*L_эфф/t_эоп*U. Традиционно при расчете подвижностей длину капилляра выражают в сантиметрах, время миграции в секундах, а разность потенциалов в вольтах.

Электрофоретическая подвижность частицы, μ_эф (electrophoretic mobility, μ_ep) — по аналогии с предыдущей величиной представляет собой отношение электрофоретической скорости частицы к напряженности электрического поля и может быть вычислена: μэф = L_общ*L_эфф/t_м*U.

В поверхностно-немодифицированном кварцевом капилляре, заполненном  водным буферным раствором, силанольные  группы (SiOH), находящиеся на внутренней стенке капилляра, приобретают анионную форму (SiO^-). Поверность капилляра становится заряженной даже при довольно низком pH (pH=4). Катионы или растворённые вещества, имеющие частичный положительный заряд в среде буферного раствора, электростатически притягиваются к отрицательно заряженной стенке, формируя двойной электрический слой, и создают разность потенциалов на очень малом расстоянии от стенки. Создаваемый потенциал называют дзета-потенциалом. Когда к концам капилляра прикладывается напряжение, катионы, образующие двойной слой, притягиваются к катоду. Из-за того, что они сольватированы, их движение вызывает объёмное смещение раствора. Это движение основной массы раствора под действием электрического поля и называется ЭОП. Образуется типичный только для капиллярного электрофореза идеально плоский профиль ЭОП, что частично объясняет большую эффективность и разделяющую способность (более 10⁵ теоретических тарелок.)

 

 

Рисунок 2. Влияния профиля потока на ширину зоны вещества.

 

Метод капиллярного электрофореза основан на разделении заряженных компонентов сложной смеси в кварцевом капилляре под действием приложенного электрического поля. Микрообъем анализируемого раствора (~2 нл) вводят в кварцевый капилляр, предварительно заполненный подходящим буфером — электролитом. После подачи высокого напряжения (до 30 кВ) к концам капилляра компоненты смеси начинают двигаться с разной скоростью, зависящей, в первую очередь, от заряда и массы (точнее, величины ионного радиуса) и, соответственно, в разное время достигают зоны детектирования. Полученная последовательность пиков называется электрофореграммой; качественной характеристикой вещества является время миграции, а количественной — высота или площадь пика, пропорциональная концентрации вещества.

В приборах для  капиллярного электрофореза капилляр, заполненный раствором электролита, своими концами опущен в два содержащих тот же электролит сосуда, в которые введены электроды. Электролит должен обладать буферными свойствами, чтобы, с одной стороны, воспрепятствовать изменению состава раствора в приэлектродных пространствах, а с другой — стабилизировать состояние компонентов пробы в процессе анализа. При подаче на электроды высокого напряжения в капилляре быстро устанавливается стационарное состояние: через капилляр протекает постоянный электроосмотический поток, на который накладывается взаимно противоположная электромиграция катионов и анионов. Если в капилляр со стороны анода ввести небольшой объем раствора пробы, то ЭОП будет переносить эту зону к катоду (в область детектирования), и зона некоторое время сможет находиться в капилляре под воздействием электрического поля высокого напряжения. В течение этого времени заряженные компоненты пробы будут перемещаться в соответствии с их электрофоретическими подвижностями.

Катионные компоненты пробы, двигаясь к катоду, будут обгонять электроосмотический поток. Скорость их движения складывается из скорости ЭОП и скорости электромиграции, поэтому на выходе капилляра катионы появляются первыми и тем раньше, чем больше их электрофоретическая подвижность. Нейтральные компоненты пробы способны перемещаться только под действием электроосмотического потока, тогда как анионные будут перемещаться к аноду со скоростями меньшими, чем скорость ЭОП. Медленно мигрирующие анионы появятся на выходе после ЭОП, а те, чья скорость электромиграции по абсолютной величине превышает скорость ЭОП, будут выходить из капилляра в прианодное пространство.

 

            Рисунок 3. Система капиллярного электрофореза «Капель-105»

 

В настоящее  время известны несколько основных вариантов капиллярного электрофореза: капиллярный зонный электрофорез (КЗЭ) или электрофорез в свободном капиллярном потоке; мицеллярная электрокинетическая хроматография (МЭКХ); капиллярное изоэлектрическое фокусирование (КИЭФ); капиллярный гель-электрофорез (КГЭ); капиллярный изотахофорез (КИТФ); капиллярная электрохроматография (КЭХ) и другие [4].

Из перечисленных  видов наиболее широкоиспользуемые виды – КЗЭ и МЭКХ.

При КЗЭ разделение проводится непосредственно в среде  электролита  и оно основано на отличиях в относительных электрофоретических  скоростях миграции индивидуальных компонентов образца. Скорость движения иона прямо пропорциональна нго электрофоретической подвижности напряженности приложенного электрического поля. Отличия в подвижности зависят от заряда и молекулярной массы анализируемого соединения в условиях конкретной методики. Значения фактической подвижности оказываются сильно зависимыми от рН и от состава буферного раствора, используемого для разделения.

В МЭКХ к используемому  буферу добавляют ионные поверхностно-активные вещества (ПАВ, чаще всего додецилсульфат натрия ДДСН) в концентрациях выше их критической концентрации мицеллообразования. Мицеллы образуют псевдонеподвижную фазу, в которой происходит разделение анализируемых веществ. Эта техника пригодна как для нейтральных так и заряженных анализируемых соединений.

Капилляр является сердцем системы КЭ, как хроматографическая колонка в ВЭЖХ.

В системах капиллярного электрофореза используют, как правило, капилляры из высокочистого плавленого кварца, прозрачного в УФ-области спектра, с внешним полимерным, чаще полиимидным, защитным покрытием. В случае детектирования внутри капилляра полиимидное покрытие в зоне детектирования снимают, оставляя для прохождения света зону чистого кварца. Внутренний диаметр капилляров может варьироваться от 20 до 100 мкм, но чаще всего используют 50 и 75 мкм. Внешний диаметр составляет 365 мкм, длина капилляров 20–100 см. Различают общую (L_общ) и эффективную (L_эфф) длину капилляра: в первом случае речь идет о полной длине капилляра от входного до выходного конца, а во втором — об участке от входного конца до зоны детектирования (рис. 5).

Доминирующее  число разделений в КЭ ведут на непокрытых изнутри капиллярах, так называемых немодифицированных [1]. Их подготовка к анализу начинается, как правило, с промывки раствором щелочи для обеспечения диссоциации силанольных групп кварца и возникновения ЭОП. Тем не менее, анализ соединений, способных адсорбироваться на стенках кварцевого капилляра (например, белки, красители), или необходимость обращения ЭОП требуют использования покрытых капилляров (ковалентные покрытия или динамические).