Спекрофотометрия, как метод в биофизике

                              Министерство образования и науки РФ

Государственное общеобразовательное учреждение

Высшего профессионального образования

«Волгоградский  государственный университет»

Факультет естественных наук 
 
 
 

Реферат на тему

«Спекрофотометрия, как метод в биофизике» 
 
 
 

                                                                                                                  Выполнила:

Студентка группы Бб-101

Кумейко Е.А

Проверил:

Фролов  Д.М. 
 

Волгоград 2012 
 

                                            Содержание.

1.Введение…………………………………………………………………...3

2.1.Понятие  Спектрофотометрии………………………………………...4

2.2Абсорционная  спектрофотометрия……………………………….…..8

2.4Дифференциальная (разностная) спектрофотометрия…………….9 

2.5 Лазерная  Спектрофотометрия………….………………………..…..10 

3. Качественный и количественный спектрофотометрический анализ………………………………………………………………………...15

4 Заключение………………………………………………………………..17

Список  используемой литературы………………………………………18 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 

Введение. В  основе научных открытий лежат наблюдения. Ученые ищут закономерности в том ,что они видят ,слышат, чувствуют ,обоняют и осязают,чтобы формулировать теории и делать  предположения.Сначала ученые полагались исключительно на собственные органы чувств,но по мере развития науки они стали разрабатывать приборы ,которые позволили выйти за рамки этих ограничений. Телескопы помогли астрономам лучше рассмотреть небо,точно также микроскопы дали биологам возможность рассматривать все более мелкие частицы организмов в поисках знаний об устройстве живых систем. Спектрофотометры  помогли в изучении определения почти всех элементов, которые могут в малых и следовых количествах присутствовать в любых материалах.В молекулярной биофизике изучение конкретных биологических процессов основано на данных исследований физико-химических свойств биополимеров (белков и нуклеиновых кислот), их строения, механизмов самосборки, внутримолекулярной подвижности и т.д. Большое значение в биофизике имеет использование современных экспериментальных методов и прежде всего, спектрофотометрии, рентгеноструктурного анализа, электронной туннельной микроскопии, атомной силовой микроскопии, лазерной спектроскопии, различных электрометрических методов, в том числе с использованием микроэлектродной техники. Они дают возможность получать информацию о механизмах молекулярных превращений, не нарушая целостности биологических объектов. В настоящее время установлена структура около 1000 белков. Расшифровка пространственной структуры ферментов и их активного центра позволяет понять природу молекулярных механизмов ферментативного катализа, планировать на этой основе создание новых лекарственных средств. Возможности направленного синтеза биологически активных веществ, в том числе лекарственных препаратов, базируются также на фундаментальных исследованиях связи молекулярной подвижности и биологической активности таких молекул. Фотометрические и спектрофотометрические методы так же широко используются в медицине и биологии при получении информации о концентрациях веществ, находящихся в жидкостях проб, а также при определении параметров, характерных для определенного объекта. При этом, в ряде случаев, определяемые вещества окрашиваются с помощью тех или иных красителей, как это, например, имеет место при электрофоретическом фракционном анализе белков сыворотки крови . 
 
 

2.1Понятие Спектрофотометрии

Спектрофотометрия, метод исследования и анализа веществ, основанный на измерении спектров поглощения в оптической области электромагнитного излучения. Иногда под спектрофотометрией понимают раздел физики, объединяющий спектроскопию (как науку о спектрах электромагнитного излучения), фотометрию и спектрометрию [как теорию и практику измерения соотв. интенсивности и длины волны (или частоты) электромагнитного излучения]; на практике спектрофотометрия часто отождествляют с оптической спектроскопией. По типам изучаемых систем спектрофотометрия обычно делят на молекулярную и атомную. Различают спектрофотометрия в ИК, видимой и УФ областях спектра . Спектрофотометрия позволяет с высокой точностью и чувствительностью определять почти все элементы, которые могут в малых и следовых количествах присутствовать в любых материалах. Этот метод особенно полезен при определении неметаллов. 
Современные спектрофотометры, оборудованные устройствами для обработки данных, позволяют регистрировать не только обычные, но и  
производные спектры поглощения. Спектрофотометрические определения можно легко автоматизировать. Это используется, в частности, в  
проточно-инжекционном анализе.

Спектрофотометр – это прибор, позволяющий производить измерения светопоглощения образцов в узких по спектральному составу пучка света (монохроматический свет). Спектрофотометры позволяют разлагать белый свет в непрерывный спектр, выделять из этого спектра узкий интервал длин волн, в пределах которого световой пучок можно считать монохроматическим (ширина выделяемой полосы спектра 1 – 20 нм), пропускать изолированный пучок света через анализируемый раствор и измерять с высокой степенью точности интенсивность этого пучка. Поглощение света окрашенным веществом в растворе измеряют, сравнивая его с поглощением нулевого раствора. В фотометрическом спектрофотометре сочетаются два основных прибора: монохроматор, служащий для получения монохроматического светового потока, и фотоэлектрический фотометр, предназначенный для измерения интенсивности света.

Монохроматор  состоит из трех основных частей: источника  света, диспергирующего устройства (устройства, разлагающего белый свет в спектр) и приспособления регулирующего величину интервала длин волн светового пучка, падающего на раствор.

Наиболее употребительным  источником света является лампа  накаливания с вольфрамовой нитью, длины волн излучения которой лежат в пределах 350 – 2000 нм. Этот источник света пригоден для большинства аналитических целей, так как позволяет производить измерения в ближайшей ультрафиолетовой, видимой, а также в ближней инфракрасной областях спектра.

Для разложения света в спектр применяются стеклянные и кварцевые призмы, а также  дифракционные решетки. Призмы обладают довольно большой дисперсией и большой  светосилой. Кварцевые призмы дают возможность работать в ультрафиолетовой области спектра. Очень важной деталью  спектрофотометра является щель, с  помощью которой можно регулировать интенсивность светового потока: чем меньше ее раскрытие, тем меньше света проходит через нее и  тем уже интервал длин волн светового  пучка, пропускаемого щелью.Фотоэлектрический фотометр состоит из вакуумных фотоэлементов, усилителя постоянного тока и компенсирующего устройства (потенциометра), шкала которого проградуирована в единицах оптической плотности и процентах светопропускания.

Оптическая  схема спектрофотометра

Излучение от источника 1 (рис 3) или 1* падает на зеркальный конденсор 2, который направляет его на плоское поворотное зеркало 3 и дает изображение источника излучения в плоскости линзы 4, расположенной вблизи входной щели монохроматора 5.Прошедшее через входную щель падает на вогнутую дифракционную решетку 6 с переменным шагом и криволинейным штрихом. Решетка изготавливается на сферической поверхности, поэтому, помимо диспергирующих свойств, она обладает свойством фокусировать спектр. Применение переменного шага и криволинейного штриха значительно уменьшает аберрационные искажения вогнутой дифракционной решетки и позволяет получить высокое качество спектра во всем рабочем спектральном диапазоне.Дифракционный пучок фокусируется в плоскости выходной щели монохроматора 7, расположенной над входной щелью 5. Сканирование осуществляется поворотом дифракционной решетки, при этом монохроматическое излучение различных длин волн проходит через выходную щель 7, линзу 8, контрольный или измеряемый образец, линзу 9 и с помощью поворотного зеркала 10 попадает на светочувствительный слой фотоэлемента 11 или 12.Линзы изготовлены из кварцевого стекла с высоким коэффициентом пропускания в ультрафиолетовой области спектра.Для обеспечения работы спектрофотометра в широком спектральном диапазоне используются два фотоэлемента и два источника излучения сплошного спектра. Сурьмяно-цезиевый фотоэлемент с окном из кварца применяется для измерений в области спектра от 190 до 700 нм, кислородно-цезиевый фотоэлемент – для измерений в области спектра от 600 до 1100 нм. Длина волны, при которой следует переходить от измерений с одним фотоэлементом к измерениям с другим фотоэлементом, указана в паспорте спектрофотометра.Дейтериевая лампа предназначается для работы в области спектра от 190 до 350 нм, лампа накаливания - для работы в области спектра от 340 до 1100 нм. Для проверки градуировки используется ртутно-гелиевая лампа ДРГС-12.

Принцип действия .В основу работы спектрофотометра положен принцип измерения отношения двух световых потоков: потока, прошедшего через исследуемый образец, и потока, падающего на исследуемый образец (или прошедшего через контрольный образец).

Структурная схема  спектрофотометра представлена на рис. 4

Световой пучок  из осветителя попадает в монохроматор через входную щель и разлагается  дифракционной решеткой в спектр. В монохроматический поток излучения, поступающий из выходной щели в кюветное отделение, поочередно вводятся контрольный  и исследуемый образцы. Излучение, прошедшее через образец, попадает на катод фотоэлемента в приемно-усилительном блоке. Электрический ток, проходящий через резистор R_Н, который включен в анодную цепь фотоэлемента, создает на резисторе падение напряжения, пропорциональное потоку излучения, падающему на фотокатод.Усилитель постоянного тока с коэффициентом усиления близким к единице, обеспечивает передачу сигналов на вход микропроцессорной системы (далее - МПС), МПС по команде оператора поочередно измеряет и запоминает напряжения U_T и U, пропорциональные темновому потоку фотоэлемента, потоку, прошедшему через контрольный образец, и потоку, прошедшему через исследуемый образец.Устройство спектрофотометров и их характеристики могут значительно отличаться в зависимости от производителя и задач, для решения которых рассчитан прибор. Однако основные элементы конструкции у всех приборов сходны. Это источник света, монохроматор, кюветное отделение с образцом и регистрирующего детектора. В качестве источника света чаще всего используются ртутные или галогеновые лампы. Монохроматор — устройство для выделения из всего излучаемого спектра какой-то узкой его части (1-2 нм). Монохроматоры могут быть построены на основе разделяющих свет призм либо на основе дифракционной решетки. Также в некоторых приборах могут дополнительно применяться наборы светофильтров. Кюветное отделение может быть оборудовано механизмами для термостатирования, перемешивания, добавления вешеств непоспедственно в ходе процесса измерения. Для исследований малых объемов веществ может использоваться безкюветная технология, когда образец удерживается за счет сил поверхностного натяжения жидкости.

      Спектрофотометрический метод применяют и для определения в растворах концентраций нескольких веществ  при совместном присутствии. Оптическая плотность является аддитивным свойством и поэтому для смеси не взаимодействующих между собой компонентов она равна сумме оптических плотностей этих компонентов при одной и той же длине волны.Одной из задач спектрофотометрического метода является количественное определение величин, характеризующих поглощение данным веществом монохроматического излучения разных длин волн. Эти величины могут использоваться как для количественной характеристики вещества, так и для количественного определения в растворе или в смеси с другими веществами. В связи с разделением электромагнитного спектра по длине волны на определенные области имело спектрофотометрию в инфракрасной, видимой ультрафиолетовой области. В ультрафиолетовой и видимой областях проявляются электронные спектры молекул, в инфракрасной области колебательные спектры.  При спектрофотометрических измерениях оценивается поглощение света в определяемом веществе. При прохождении света через вещество часть его отражается, часть поглощается, часть рассеивается, а часть проходит через слой этого вещества. Интенсивность светового потока I₀, падающего на слой вещества, можно условно разложить на четыре составляющие: I₀=I+ I_п+ I_от+ I_р, ,где I - интенсивность светового потока, прошедшего через слой вещества; I_п - интенсивность светового потока, поглощенного веществом; I_от - интенсивность светового потока, отраженного веществом; I_р - интенсивность светового потока, рассеянного средой. Под интенсивностью света понимается мощность (энергия) светового потока, испускаемого источником света в 1 с внутри телесного угла, равного единице .

При прохождении  монохроматического светового потока через слой вещества, светопоглощение в нем характеризуется законом Бугера-Ламберта-Бера (закон колориметрии). где I, I₀- интенсивности светового потока, падающего на вещество и прошедшего через него; а - коэффициент светопоглощения; с - концентрация растворенного вещества; l - толщина поглощающего слоя. Если концентрация с выражена в молях на литр, l - в сантиметрах, то а - становится молярным коэффициентом светопоглощения ε_λ.Уравнение колориметрии принимает вид: Моль (М) единица количества вещества. В 1М содержится столько молекул, сколько содержится в 0,012 кг ¹²С (нуклида углерода с атомной массой 12). В 1 М хлорида натрия имеется 58,454 г NaCl в 1 литре раствора. Если закон светопоглощения соблюдается, то оптическая плотность раствора D прямо пропорциональна молярному коэффициенту светопоглощения ε_λ,

концентрации  вещества с и толщине раствора l

Молярный коэффициент  светопоглощения зависит от длины волны проходящего света, температуры вещества и его природы, и не зависит от концентрации растворенного вещества и толщины поглощающего слоя. Для слабоокрашенных веществ ε_λ≈ 400÷500; у наиболее интенсивно окрашенных ε_λ≈ 100000. Закон Бугера-Ламберта-Бера получен с использованием закона Бугера-Ламберта, в соответствии с которым однородные слои одного и того же вещества одинаковой толщины поглощают одну и ту же долю падающей 

на них световой энергии а также закона Бера

где K ₁- коэффициент пропорциональности. Закон Бера утверждает, что оптическая плотность раствора прямо пропорциональна концентрации растворенного вещества при постоянной толщине поглощающего свет слоя. Интенсивность светопропускания в зависимости от толщины слоя вещества и зависимость оптической плотности от концентрации вещества в растворе иллюстрируются рис. 1

Рис. 1 Кривая интенсивности светового потока в зависимости от толщины слоя вещества (а); зависимость оптической плотности от концентрации раствора (б)

Оптическая плотность  D и светопропускание связаны между собой зависимостью D= l_gT, где Т- светопропускание Оптическая плотность D измеряется в Беллах [Б]. Значение ее обычно находится в пределах 0÷2 Б, иногда до 3 Б и более. Светопропускание обычно оценивается в процентах. Оптическая плотность 0 Б соответствует 100% светопропускания, 2 Б- светопропусканию в 1% . Если используется не монохроматический, а полихроматический источник света, то вместо молярного коэффициента ε_λ в уравнения подставляется средний молярный коэффициент светопоглощения ε, зависящий от спектрального состава источника излучения. На практике наблюдаются отклонения от закона Бера, вследствие действия ряда химических факторов. Это обстоятельство приходится учитывать при проведении измерений. Молярный коэффициент светопоглощения и оптическая плотность раствора различны для разных длин волн света. Поэтому для полной характеристики растворов различных соединений используются спектры поглощения. Для этого проводят измерения оптической плотности раствора или молярного коэффициента светопоглощения при различных длинах волн D=f(λ); ε_λ= f (λ ) и строят кривые, характеризующие светопропускание. Для получения большей надежности результатов при фотометрировании стремятся использовать тот участок спектра излучения, на котором наблюдается максимальное светопоглощение данным веществом. При спектрофотометрии оценивается светопропускание лучистого излучения веществом или веществами в зависимости от длины его волны. От фотоколоритмии она отличается только тем, что в соответствующих приборах используются источники монохроматического света, интервал длин волн которых порядка (1÷2 нм). Для этого широко используются специальные светофильтры, устанавливаемые на пути прохождения световых потоков перед поглощающим свет веществом.