Фотоэлектроколориметр

Активность  каталазы выражается каталазным числом, которое представляет собой количество перекиси водорода в миллиграммах, разложенной 1 мл³ крови за 30 минут. Показателем каталазы называют соотношение каталазного числа к количеству миллионов эритроцитов в 1 мкл исследуемой крови.

Ход работы. С помощью микропипетки берут кровь из пальца человека или хвоста/уха экспериментального животного и готовят гемолизат крови, разводя ее в 1000 раз в мерной колбе (0,1 мл в 100 мл дистиллированной воды).

В 2 колбочки или широкие пробирки отмерить по 7 мл дистиллированной воды и по 2 мл 1% раствора пероксида водорода. В опытную колбу/пробирку прилить 1 мл разведенной в 1000 раз крови. Обе  колбы/пробирки – опытную и контрольную  – оставить на 30 минут при комнатной  температуре. По истечении указанного времени в обе пробы добавить по 3 мл 10 % раствора серной кислоты, которая  прекращает действие каталазы. Содержимое опытной и контрольной проб оттитровать 0,1 н раствором перманганата калия  до слабо-розового цвета.

Расчет. Допустим, что на титрование опытной пробы пошло 4,5 мл 0,1 н раствора КМnО₄, а контрольной – 12,6 мл 0,1 н раствора КМnО₄. 0,1 н раствора КМnО₄ соответствует 1 мл 0,1 н Н₂О₂, а 1 мл Н₂О₂ соответствует 1,7 мг Н₂О₂. Следовательно, в данном случае каталазное число соответствует: (12,6 – 4,5) × 1,7 = 13,77 единиц.

Показатели  нормы. Каталазное число крови у людей колеблется в пределах от 11 до 20 единиц. В клинике чаще используется показатель каталазы, который в норме составляет 2-3×10^-6.

Клинико-диагностическое  значение. Высокая активность каталазы наблюдается при пернициозной и макроцитарной анемии, а также при введении в организм кофеина, ацетоновых тел, алкоголя. Активность каталазы в крови снижается при ряде заболеваний: раке, анемии, туберкулезе и др

 
16. Количественное  определение содержания гемоглобина  крови.

Определение  содержания  гемоглобина в  крови  цианметгемоглобиновым  методом по Драбкину.

           Принцип метода.   Гемоглобин окисляют в метгемоглобин (гемиглобин) железосинеродистым калием (красная кровяная соль), образующийся с ацетонциангидрином окрашенный цианметгемоглобин (гемиглобинцианид) определяют колометрически.

            Ход работы.  В пробирку (опыт) (осторожно!) отмерить 5 мл. трансформирующего раствора (реактив Драпкина), к нему добавить 0,02 мл крови (разведена в 251 раз). В другую пробирку (стандарт)  прилить 5 мл реактива Драпкина и 0,02 мл стандартного раствора. Содержимое обеих пробирок  перемешать и в течение 30 минут выдержать при комнатной температуре. Измерить  экстинцию опытной и стандартной проб на ФЭКэ при длине волны 500-560 нм (зеленый светофильтр) в кювете с толщиной слоя 1 см против холостой пробы (трансформирующий раствор).

          Расчет  содержания гемоглобина произвести по формуле:

Hb(г/л)=Е_оп/Е_ст ×С × К × 0,01, где

Е_оп – экстинкция опытной пробы;

Е_ст – экстинкция стандартного раствора;

С –  концентрация    гемиглобинцианида     в   стандартном    растворе (59,75 мг/100мл);

К – коэффициент разведения крови (251);

0,01 – коэффициент пересчета  мг/100 мл в г/л. 

Сопоставить с нормой  содержания у здоровых людей и сделать вывод.

      У здоровых людей концентрация гемоглобина колеблется в следующих пределах:

- новорожденные – 210 – 225 г/л;

- дети в возрасте 1 месяца –  145 - 165 г/л;

- дети в возрасте 6 месяцев –  115 - 130 г/л;

- дети в возрасте 1 года –  110 - 120 г/л;

- дети в возрасте  14-15 лет  – 130 -150г/л;

- взрослые женщины – 120 - 140 г/л,  мужчины – 135 - 160г/л.

Клинико-диагностическое  значение определения содержания гемоглобина  в крови: снижение содержания гемоглобина в крови наблюдается при анемиях различного генеза, при острых и хронических кровотечениях, некоторых инфекционных заболеваниях; повышение – при сгущении крови, при заболеваниях, связанных с увеличением количества эритроцитов (эритремии) и др.

 
17. Количественное  определение билирубина в сыворотке крови по методу Иендрашека.

Количественное  определение билирубина в сыворотке  крови по методу Иендрашека.

Принцип метода. В основе метода Иендрашека лежит реакция Ван ден Берга, описавшего способность билирубина давать розово-фиолетовое окрашивание с диазореактивом Эрлиха. Интенсивность образующейся окраски прямо пропорциональна концентрации билирубина в растворе. Разрушение билирубин-альбуминового комплекса (свободный, или непрямой билирубин) осуществляется кофеиновым реактивом, который одновременно переводит билирубин в растворимое диссоциированное состояние. Интенсивность образующейся окраски измеряется на ФЭКе при зеленом светофильтре (563 нм), а количество билирубина определяется по калибровочному графику.

Ход работы. В 3 пробирки отмерить указанные в таблице реактивы и колориметрировать через 5 - 10 мин. на ФЭКе в кювете 10 мм против контроля при зеленом светофильтре.

По калибровочному графику определить содержание общего и связанного билирубина. Вычитая  из уровня общего билирубина количество прямого, рассчитать содержание непрямого (свободного) билирубина. Сопоставить  с нормой содержания у здоровых людей  и сделать вывод.

Реактивы	Пробирки
	1-я	2-я	3-я
Сыворотка крови	1 мл	1 мл	1 мл
Кофеиновый реактив	3,5 мл	3,5 мл	-
Диазореактив	0,5 мл	-	0,5 мл
Физиологический раствор	-	0,5 мл	3,5 мл
Типы билирубина	общий	контроль	прямой (связанный)

Нормальное  содержание билирубина в крови – 8,5 – 20,5 мкмоль/л; 75% общего билирубина составляет непрямой (свободный), 25% - прямой (связанный) билирубин.

Клинико-диагностическое  значение определения содержания билирубина в сыворотке крови: определение общего билирубина и его фракций используется для диагностики и дифференциальной диагностики желтух различной этиологии – гемолитической (надпеченочной), паренхиматозной (гепатоцеллюлярной, печеночной) и обтурационной (механической, подпеченочной). При гемолитической желтухе гипербилирубинемия развивается в основном за счет непрямого (свободного) билирубина. При паренхиматозной желтухе происходит деструкция гепатоцитов и нарушается экскреция прямого билирубина в желчные ходы, он попадает в кровь. Кроме того из-за функциональной несостоятельности гепатоциты не способны эффективно захватывать из крови непрямой билирубин и конъюгировать его. При паренхиматзной желтухе наблюдается гипербилирубинемия смешанного типа. При обтурационной желтухе нарушается эвакуация желчи в двенадцатиперстную кишку, что приводит к повышению в крови прямого, а в более поздние сроки болезни и непрямого билирубина.  
18. Пробы коллоидной устойчивости плазмы крови Вельтмана и тимоловая

Пробы коллоидоустойчивости белков сыворотки крови.

А. Тимоловая проба

Принцип метода. Метод основан на образовании плохо растворимого глобулино-тимололипидного комплекса при взаимодействии сыворотки крови с тимоло-вероналовым буфером.

Ход работы. К 6 мл тимоло-вероналового буфера (рН 7,6) прибавить 0,1 мл негемолизированной сыворотки крови и через 30 минут отколориметрировать при красном светофильтре в кюветах толщиной 10 мл против тимоло-вероналового буфера. Расчет произвести по калибровочному графику.

В норме интенсивность помутнения колеблется в пределах от 0 до 4 условных единиц.

 

Б. Проба Вельтмана

Принцип метода. Метод основан на нарушении коллоидоустойчивости белков сыворотки крови в присутствии раствора хлористого кальция при нагревании.

Ход работы. К 0,1 мл негемолизированной сыворотки крови прилить 4,9 мл воды, перемешать и нагреть над пламенем спиртовки до однократного закипания пробы. Охладить смесь и посмотреть ее содержимое на свет. Если в пробирке нет единичных хлопьев коагулированного белка, добавить еще 0,1 мл 0,5% раствора хлористого кальция и вновь прокипятить. Процедуру повторять до тех пор, пока не выпадут хлопья.

В норме коагуляции наступает при добавлении 0,4 - 0,5 мл раствора хлористого кальция.

Клинико-диагностическое. Осадочные пробы широко распространены в клинической практике. Данная группа проб основана на исследовании изменений коллоидной устойчивости белков сыворотки крови при патологических состояниях, сопровождающихся диспротеинемией (воспалительные заболевания, заболевания печени и почек и др.). Лабильность сывороточных белков, определяемая в первую очередь соотношением крупно- и мелкодисперсных фракций (альбумины/глобулины) и снижением коллоидоустойчивости при действии различных денатурирующих агентов, может быть связана с относительным увеличением глобулинов при уменьшении альбуминов. Большое значение имеет и относительное увеличение γ-глобулинов в глобулиновой фракции.