Биологические мембраны. История открытия

Представленные  методы применяются при исследовании практически всех видов клеточных  мембран.

Рис. 2.3. Иерархия моделей биологических мембран

Один из способов конструирования искусственного липидного бислоя: один монослой образуется на границе раздела вода - гептан, другой - вокруг капли водного раствора, внесенного пипеткой в гептан; при их соприкосновении появляется истинный двойной слой.

1.1.3 Состав и структура биологической мембраны

Как отмечалось выше, основными компонентами биологических  мембран являются липиды, белки и  углеводы, причем в процентном отношении  большая часть массы приходится на долю белков и липидов. Кроме того, в мембранах выявлены такие минорные компоненты, как нуклеиновые кислоты, полиамины и неорганические ионы, а также связанная вода. Соотношение основных структурных компонентов - белков и липидов - значительно колеблется в зависимости от вида мембраны. Так, в мембранах митохондрии массовая доля белка составляет 60 - 65%, а липидов - 35 - 40%. В миелиновой оболочке нерва содержится всего 20 - 40% белка, остальные 60 - 80% составляют липиды. В табл.2.1 приводятся данные об относительном содержании белков и липидов в мембранах различных клеточных органелл.

Таблица 2.1 Содержание белков и липидов в различных мембранах*,%

1.2 Мембранные белки

Белки, входящие в состав мембран, как правило, гидрофобные  глобулярные структуры, достаточно прочно связанные с мембранами за счет не только гидрофобных, но и электростатических взаимодействий. По степени влияния  на структуру бислоя и силе взаимодействия с мембраной белки делятся на интегральные и периферические: первые пронизывают мембрану, их трудно выделить без разрушения целостности мембраны; вторые локализованы на поверхности липидного бислоя мембраны и легко экстрагируются. Основную роль в ориентации интегральных белков в мембране играют гидрофобные взаимодействия. Периферические белки удерживаются на мембране преимущественно электростатическими взаимодействиями. Молекулы периферических белков разрушаются протеолитическими ферментами полностью, а интегральных белков - частично; протеолизу подвергаются лишь те компоненты интегральных белков, которые вступают в контакт с гидрофильной средой.

В настоящее  время идентифицировано более 30 мембранных белков с относительной молекулярной массой 10 000 - 240 000. Мембранные белки выполняют различные функции. Наиболее широко распространены белки-ферменты: интегральные и периферические. Рецепторы и белки, определяющие иммунную реакцию клетки, могут быть как интегральными, так и периферическими компонентами мембран. Часто рецепторы входят в состав более сложных мембранных комплексов, содержащих "белки-исполнители". Отметим, что структурные белки, в частности белки цитоскелета, в основном периферические.

Четыре способа  ассоциации мембранных белков с липидным бислоем. Некоторые белки пронизывают бислой насквозь, некоторые удерживаются нековалентными взаимодействиями с другими мембранными белками. Окончательно не выяснено, существуют ли белки, лишь частично погруженные в бислой. Есть мембранные белки, к которым ковалентно присоединена одна или более цепей жирных кислот, помогающих белку "заякориваться" в том или другом монослое. Хотя большинство таких белков являются трансмембранными, некоторые могут ими и не быть

Рассматривая  характер липид-белковых взаимоотношений в мембране, необходимо отметить, что данные процессы протекают на фоне латеральной диффузии белков и липидов, а также "флип-флоп"-перехода липидов. Под латеральной диффузией понимают хаотическое тепловое перемещение белков и липидов в плоскости мембраны. Этот показатель определяется рядом параметров, которые связаны следующими соотношениями:

где i?"¹ - частота обмена молекул местами, с^-1; D - коэффициент латеральной диффузии, м²/с; А - площадь молекулы фосфолипида, м²; S - расстояние, перескакиваемое молекулой при ЛД; t - время перескока, с.

Под "флип-флоп"-переходом  фосфолипидов в мембране подразумевается  перемещение молекул из одного монослоя в другой; процесс продолжается в  течение 15 - 60 мин и является основой  асимметричного распределения фосфолипидных молекул по разные стороны мембран. Явление асимметрии обеспечивает постоянство пространственного расположения липидов и структурную организацию липид-белковых комплексов.

1.2.1 Структура мембранных белков

Основная роль липидов в составе мембран заключается в стабилизации бислойной структуры, а белки являются активными компонентами биомембран.  
 
Используя мембрану эритроцитов как модель, исследователи выявили два типа мембранных белков. Белки первого типа, называемые периферическими белками, связаны с мембраной в основном ионными взаимодействиями. Если обработать препарат мембран буферным раствором с высокой концентрацией солей, белки этого типа освобождаются от мембраны и переходят в буфер. Примеры периферических белков – фибронектин (локализован на наружной поверхности большинства клеток, исключая циркулирующие клетки крови) и спектрин (находится на внутренней поверхности большинства клеточных мембран, особенно в эритроцитах).  
 
Мембранные белки второго типа называются интегральными белками. Эти протеины или погружены в толщу липидного бислоя, или пронизывают мембрану насквозь (трансмембранные белки). К интегральным относят также белки, ковалентно связанные с молекулами мембраны. Все интегральные белки можно выделить. только разрушив мембрану. Для выделения и изучения интегральных белков их очищают от липидов, либо экстрагируя их органическими растворителями (такими как ацетон или спирты), либо растворяют липиды с помощью детергентов. Большинство мембранных белков являются интегральными.  
 
На заре развития мембранологии полагали, что мембранные белки по своей структуре довольно гомогенны и уложены в виде ?-слоев по поверхности бислоя. Сейчас принято считать, что большинство мембранных белков в своей мембранной части состоят из одной или нескольких ассоциированных ?-спиралей, многие мембранные белки олигомеризуются. Причем “правильная” олигомеризация ?-спиралей является необходимым условием выполнения белком своей функции. Наиболее изученным из олигомеризующихся мембранных белков является белок эритроцитов человека - гликофорин А, который образует устойчивый димер не только в природных системах, но и в искусственных липидных средах, таких как мицеллы додецилфосфохолина (DPC). Интегральные мембранные белки могут оказаться гораздо сложнее, чем мы сейчас представляем. Классификация растворимых белков по типам структур была проведена только после того, как установили с высоким разрешением структуру более 100 различных белков. Что касается трансмембранных белков, то это удалось сделать только в одном случае - для белка фотосинтетического реакционного центра бактерий. Вместе с электронно-микроскопическими данными низкого разрешения о структуре бактериородопсина это единственный источник, на котором может основываться построение моделей для большинства других трансмембранных белков. Молекулярная масса мембранных белков обычно варьирует в пределах от 10 тыс. до 240 тыс.  
 
Еще один важный момент - способы прикрепления белков к мембране: 
 
1. Связывание с белками, погруженными в бислой. В качестве примеров можно привести F1-часть Н + - АТРазы, которая связывается с Fo-частью, погруженной в мембрану; можно упомянуть также некоторые белки цитоскелета.  
 
2. Связывание с поверхностью бислоя. Это взаимодействие имеет в первую очередь электростатическую природу (например, основный белок миелина) или гидрофобную (например, поверхностно-активные пептиды и, возможно, фосфолипазы). На поверхности некоторых мембранных белков имеются гидрофобные домены, образующиеся благодаря особенностям вторичной или третичной структуры. Указанные поверхностные взаимодействия могут использоваться как дополнение к другим взаимодействиям, например к трансмембранному заякориванию.  
 
3. Связывание с помощью гидрофобного "якоря"; эта структура обычно выявляется как последовательность неполярных аминокислотных остатков (например, у цитохрома 65). Некоторые мембранные белки используют в качестве якоря ковалентно связанные с ними жирные кислоты или фосфолипиды.  
 
4. Трансмембранные белки. Одни из них пересекают мембрану только один раз (например, гликофорин), другие - несколько раз (например, лактозопермеаза; бактериородопсин).  
 
Различиями между наружными (или периферическими) и внутренними (или интегральными) мембранными белками не задается однозначно способ их прикрепления к бислою; эти различия определяют лишь относительную силу их связывания.  
 
 
 
Рис. 1 
 
Различные способы прикрепления мембранных белков к мембране. Пептидный якорь (4) может находиться либо на N-, либо на С-конце молекулы. N – и С-концы трансмембранных белков (5 и 6) могут находиться как у наружной, так и у внутренней поверхности мембраны. 

1.2.2 Выделение мембранных белков

Очистка и характеристика мембранных белков ставят перед исследователем целый ряд специфических проблем, с которыми он обычно не сталкивается, работая с растворимыми белками. Мембранные белки, как правило, прочно связаны с липидным бислоем и  фактически нерастворимы в воде. Поэтому для их солюбилизации и очистки приходится применять детергенты или другие разрушающие мембрану вещества. Поскольку выделение интегральных белков обычно сопряжено с разрушением мембраны, во многих случаях необходимо убедиться, что в процессе выделения и очистки белка его функциональная активность не оказалась нарушенной или утраченной. Для этого, в частности, можно попытаться провести реконструкцию, т.е. встроить очищенный белок обратно в мембрану. Функциональную активность некоторых мембранных белков, таких, как ионные каналы или транспортные белки, можно охарактеризовать и измерить только в реконструированных мембранных системах. Для других мембранных белков, выполняющих функции ферментов или рецепторов, полезную информацию часто можно получить, используя солюбилизированные препараты. Методы солюбилизации и реконструкции не только дают ценную информацию о функциях мембранных белков; их можно также использовать для того, чтобы перевести эти белки в состояние, удобное для проведения детального структурного анализа. Несомненно, детергенты будут играть ключевую роль в совершенствовании методов кристаллизации мембранных белков для последующего рентгеноструктурного анализа.  
 
При солюбилизации детергентами возникает вопрос о возможности избирательного извлечения из мембраны именно тех компонентов, которые интересуют исследователя. Поэтому любой новый детергент желательно проверять на возможность избирательной экстракции определенных мембранных компонентов. Ни один из имеющихся детергентов не является универсальным.  
 
Это обусловлено тремя обстоятельствами:  
 
1) сильными различиями в действии детергентов даже на одни и те же мембранные белки;  
 
2) отсутствием единой стратегии солюбилизации и реконструкции;  
 
3) сложным характером взаимодействий между молекулами белков, липидов и детергентов, имеющих столь разную химическую природу.  
 
Существуют определенные требования к детергентам, применяемым для солюбилизации и реконструкции. Детергент должен солюбилизировать, но не денатурировать белок и должен быть легко доступен в чистом виде; желательно, чтобы детергент был недорогим.

Глава II.Биофизические методы изучения мембранных белков

В становлении  и уточнении современных представлений  о структуре мембран большую  роль сыграли не только методы морфологии и особенно биохимии, ранее зарекомендовавшие себя при изучении метаболизма и функции белков в водной среде, но и специфические биофизические методы, которые позволили изучать структуру этих сложных надмолекулярных гетерогенных оборазований.

2.1 Спектральные методы

Для определения  содержания ? - спиралей и ? - слоев в  мембранных белках используют несколько  методов. В отсутствие трехмерной организации  на их основе можно попытаться построить  соответствующие модели. Чаще всего  используется метод кругового дихроизма (КД). Все более широкое применение находят инфракрасная и рамановская спектроскопия, а также ЯМР. 

2.2 Метод кругового дихроизма

Метод основан  на измерении разности поглощения лево - и правополяризованного света; эта  оптическая активность является мерой хиральности молекул, или мерой их асимметрии. В дальней ультрафиолетовой области (от 190 до 240 нм) КД определяется в основном поглощением амидов карбонильных групп полипептидного остова. При наличии участков вторичной структуры, например ?-спиралей, спектр КД имеет вполне определенные особенности, связанные с особенностями электронного окружения амидных групп в этих структурах. Анализируя спектр КД белков, его обычно представляют как сумму компонентов, отвечающих поглощению разных участков белковой молекулы: ?-спиралей, ?-слоев и случайных клубков. Определив тем или иным способом спектры каждой из этих структур, производят их суммирование, подбирая соответствующие коэффициенты таким образом, чтобы было достигнуто наилучшее соответствие измеренному спектру. Подобранные весовые коэффициенты представляют собой ту долю, которая приходится в молекуле на каждый из типов вторичной структуры.  
 
Эти методы были разработаны для растворимых белков, но нет никаких оснований сомневаться, что их можно с успехом применять и для мембранных белков. Скорее всего, у последних имеются участки с такими же типами вторичной структуры, как и у растворимых белков, и при их изучении возникнут такие же трудности. Некоторые белки можно изучать in situ, используя суспензии мембран. Примерами такого рода являются бактериородопсин из пурпурной мембраны Halobacterium halobium и Са2 + - АТР-аза из мембраны саркоплазматического ретикулума. Очищенные мембранные белки можно исследовать с помощью КД и в присутствии детергентов, если поглощение последних в дальней УФ-области не слишком велико, или в составе реконструированных везикул. Здесь возникают две проблемы:  
 
1) дифференциальное светорассеяние, когда размер мембранных частиц гораздо больше длины волны света;  
 
2) выравнивание поглощения из-за концентрирования белка в мембранах или везикулах, т.е. из-за негомогенности его распределения в растворе. Эти артефакты могут быть весьма существенными, однако их можно учесть с помощью соответствующих методов.  
 
К сожалению, для внутренних мембранных белков отсутствуют структурные данные высокого разрешения, поэтому точная интерпретация спектров КД невозможна. За исключением нескольких случаев, разные спектральные методы не использовались для изучения одного и того же белка и количественное сравнение результатов не проводилось. Интересно, что для бактериородопсина, который исследовали методами КД, ИК и ЯМР, во всех трех случаях были получены одинаковые результаты, свидетельствующие о значительном содержании в этом белке ?-слоев. Тем не менее у каждого метода имеются существенные недостатки. Так, данные о высоком содержании в бактериородопсине ?-слоев (-46 процентов) в значительной мере зависят от способа учета оптических артефактов. Судя по данным электронно-микроскопической реконструкции, характеризующимся относительно низким разрешением, в бактериородопсине 80 процентов приходится на долю ?-спиралей, а ?-слои отсутствуют совсем. Чтобы понять причину этих несоответствий, необходимо провести структурный анализ белка с атомным разрешением. 

2.3 Инфракрасная спектроскопия и спектроскопия комбинационного рассеяния

 
Эти методы не только позволяют получить сведения о конформации мембранных липидов, но и могут использоваться для исследования вторичной структуры  белков. Колебательный спектр полипептидного остова зависит от типа вторичной структуры и дает информацию о содержании в молекуле ? - и ? - структур. Этими методами можно исследовать высушенные на воздухе пленки, водные суспензии мембран, а также очищенные белки как в присутствии детергента, так и в составе реконструированных везикул.

2.4 ЯМР-спектроскопия

Этот метод  также может использоваться для  изучения мембранных белков. Однако возможности  метода в этом случае ограничены, что  связано главным образом с  относительно медленными движениями интегральных мембранных белков in situ и в комплексах с детергентом.

2.5 Определение ферментативной активности

Одним из наиболее важных методов характеристики очищенных  мембранных белков несомненно является определение биохимической активности. При этом используются в основном такие же критерии, как и для растворимых белков, но могут возникать и свои трудности. Первая из них связана с тем, что биохимическая активность мембранных белков часто очень сильно зависит от связывания с белком липидов и детергентов. Потеря активности может быть как обратимой, так и необратимой. Целесообразно иметь какую-то оценку удельной активности исследуемого белка in vivo или в составе мембран до солюбилизации. Избыток детергента может оказывать ингибирующий эффект, например за счет разбавления неполярных субстратов в популяции мицелл и уменьшения ферментативной активности. Измеряя активность любого мембранного белка, необходимо иметь в виду, что in situ он находится в окружении липидов, обеспечивающих оптимальную активность. Вторая проблема связана с белками, обладающими "трансбислойной" активностью; примерами могут служить белки, образующие каналы, и транспортные белки. В этих случаях необходимо учитывать перемещение растворенных веществ из одного компартмента в другой (например, внутрь липосом и наружу).

2.6 Изучение стехиометрии субъединиц

Многие мембранные ферменты представляют собой комплексы, состоящие из нескольких субъединиц. В качестве примера можно привести Н + - АТРазу, Na +/ К + - АТРазу, митохондриальные комплексы электронного транспорта и фотосинтетические реакционные центры. Некоторые интегральные мембранные белки прочно связаны с растворимыми белками с помощью нековалентных взаимодействий (примерами могут служить Fo - и F1-компоненты митохондриальной Н + - АТРазы). В Е. сoli Fo-компонент, содержащий по данным электрофореза в ПААГ-ДСН три типа субъединиц (а, b, с), образует протонный канал, a F1, состоящий из пяти типов субъединиц, содержит активный центр, участвующий в гидролизе АТР. Для таких белков очень важно определить характер субъединиц, стехиометрию комплекса и ближайшие взаимодействия его компонентов. Это весьма непростая задача даже тогда, когда белковый комплекс уже изолирован. Возникающие здесь проблемы по существу не отличаются от таковых для растворимых белковых комплексов, но имеются и свои дополнительные сложности.  
 
Прежде всего, следует иметь в виду, что взаимодействие между субъединицами очень сильно зависит от типа липидов и детергентов, с которыми связаны белки.  
 
Еще одна проблема связана с тем, что в бислое мембранные белки могут образовывать комплексы из-за высокой их локальной концентрации. При солюбилизации же независимо от используемого детергента может произойти разбавление мембранных белков и их разъединение. По закону действующих масс это приведет к диссоциации комплексов, в которых взаимодействие между компонентами не очень сильное.  
 
Для изучения стехиометрии субъединиц и их ассоциации в очищенном комплексе используется всего несколько методов:  
 
1) химическое сшивание;  
 
2) количественный анализ N-концевых аминокислот;  
 
3) определение отношения массы субъединиц в ДСН-полиакриламидных гелях путем определения интенсивности окрашивания, с помощью радиоавтографии или иммуноблоттинга.  
 
Каждый метод имеет свои ограничения, но все они использовались на практике.