Трубчатый теплообменник

Кроме морфологической, дается оценка эмбрионов по адсорбционным  свойствам оболочек и цитоплазмы бластомеров к различным красителям. Для улучшения морфологической оценки используют флюоресцентную окраску, позволяющую отличить живые эмбрионы от погибших. В частности, этот метод наиболее пригоден для оценки жизнеспособности эмбрионов крупного рогатого скота после их культивирования и замораживания. С помощью флюоресцентных красящих веществ FDA и DAP1 через 3-10-минутный период возможно быстрое и достаточно надежное определение способности эмбрионов к развитию в ранних стадиях. Живые эмбрионы и даже живые бластомеры ярко флюоресцируют после инкубации в FDA, но не флюоресцируют после инкубации в DAP1. У погибших эмбрионов или бластомеров реакции обратные. Эти методы позволяют более точно определять жизнеспособность эмбрионов под микроскопом. 

Ряд авторов предлагает использовать синьку Эванса. В живых эмбрионах при температуре 37 градусов ею окрашивается только зона пеллюцида, которую затем обесцвечивают в растворе Рингера. В мертвых же эмбрионах краска прочно фиксируется на бластомерах. 

Как считает М. И. Прокофьев [2], могут быть гистохимические методы оценки жизнеспособности эмбрионов, основанные на специфических реакциях структурных элементов и веществ клеток к витальным и флюоресцентным красителям. Такие реакции протекают очень интенсивно и быстро, что позволяет ускорить процесс оценки эмбрионов. 

Однако следует  учитывать, что флюоресцентная окраска  лишь дополняет и улучшает основной метод оценки эмбрионов - морфологический. Наиболее важными морфологическими признаками при оценке жизнеспособности эмбрионов служат объем, окраска, расположение клеток, величина перивиталлинового пространства и вид неповрежденной зоны пеллюцида. Идеальный эмбрион должен быть компактным, сферической формы, с однородной окраской, с клетками одинаковой величины, с гладкой, плоской и равномерно сформированной зоной пеллюцида, без включений в перивителлиновом пространстве. 

Важнейшим критерием  для оценки качества эмбрионов является интенсивность развития стадий. Эмбрионы с замедленным развитием не используются для пересадки, замораживания и других манипуляций. 

При оценке качества эмбриона в нашей стране принята 5-балльная шкала с учетом следующих  показателей: соответствия стадии развития эмбриона его возрасту; правильности формы прозрачной оболочки и ее целостности; равномерности дробления бластомеров, состояния цитоплазмы; прозрачности перивителлинового пространства. 

Наиболее пригодными для трансплантации являются эмбрионы, извлеченные из матки коровы-донора на 7-8 сутки после первого осеменения. Как показывают результаты исследований и практика, в это время нормально развитые эмбрионы, пригодные для трансплантации реципиентам, находятся в стадии поздней морулы или бластоцисты. Эти эмбрионы используют для пересадки гормонально подготовленным коровам-реципиентам. 

Выбраковке подлежат дегенерированные неоплодотворенные яйцеклетки (ооциты), которые можно обнаружить при извлечении эмбрионов. Морфологически неинтактные, непригодные для трансплантации эмбрионы имеют дефектную морулу, или бластоцисту, признаками которых являются дефекты прозрачной оболочки, распад бластомеров, разная величина бластомеров, нарушение межклеточной связи. 

В стадии поздней  бластоцисты непригодные для  трансплантации эмбрионы характеризуются  деформацией и ослаблением бластомеров, разрывом межклеточных связей и целостности зоны пеллюцида.(1)  

Пересадка эмбрионов  реципиентам. 

В качестве реципиента отбирают гинекологически здоровых коров после двух-трех нормальных половых циклов. Для отбора реципиентов  основным показателем является отсутствие гинекологических отклонений, а продуктивные, племенные и породные качества большой роли не играют. Вместе с тем, у реципиентов с плохой упитанностью, низкой оплодотворяемостью после первого осеменения, могут плохо приживаться эмбрионы. В среднем на каждого донора отбирают 5-6 реципиентов. 

При современном  уровне техники трансплантации рекомендуется  пересаживать эмбрионы сразу после  их извлечения из рогов матки донора и оценки. 

В настоящее  время пересадка эмбрионов реципиентам  производится хирургическим и нехирургическим  способами. При пересадке нужно точно знать местонахождение эмбриона в половых путях коровы. Это связано с переходом предимплантационного периода, в котором находится эмбрион до пересадки, в новый период эмбрионального развития - имплантационный. При естественном течении эмбрионального периода зародыш на стадии морулы или бластоцисты находится в верхнем отделе рога матки, поэтому и наиболее благоприятным местом для его аппликации является верхняя часть рога матки реципиента. Установлено, что пересадка эмбрионов глубоко в рог матки реципиента лучше всего обеспечивается хирургическим способом. При нехирургической же пересадке, которая происходит в период диэструса,  место аппликации эмбриона в роге матки контролируется менее точно. 

Эффективность хирургического способа пересадки эмбриона составляет 60-70%, а число телят - 3-4 на донора. Хирургический способ использовали в основном до середины 70-х годов. Однако он требует больших затрат средств. Кроме того, широкое применение хирургического метода сдерживается сложностью проведения операций в производственных условиях, получением травм вследствие резекции мышц, и невозможностью многократного использования реципиента. Поэтому последнее время пересадку эмбрионов в основном осуществляют нехирургическим способом. 

При нехирургической пересадке основным достоинством, кроме простоты и экономичности, является возможность многократного использования реципиента. Разработано несколько способов нехирургической пересадки эмбрионов. Однако все они основаны на одном принципе - введении эмбриона в рог матки через шейку, вследствие чего этот способ назван также цервикальным. 

После пересадки  эмбрионов проводят тщательный контроль над реципиентами, обращая особое внимание на возможное проявление у  них повторной половой охоты. 

Для установления стельности у коров-реципиентов используют несколько методов: визуальный; по уровню прогестерона в крови или молоке; клинический, главным образом путем ректальной пальпации. 

Важным звеном селекционно-племенной работы является достоверность установления истинного происхождения телят, полученных при трансплантации эмбрионов от генетически ценных родителей. Истинное происхождение можно установить по группам крови и типам белков крови. Пробу крови берут у теленка в возрасте от 4 недель до 4 месяцев. 

Существенной  причиной, снижающей эффективность  нехирургической пересадки эмбрионов, является возможное повреждение  эндометрия при введении катетера. В то же время обобщение результатов  исследований по нехирургической пересадке  эмбрионов показывает, что эффективность пересадки в большей степени зависит не от того, как глубоко будет введен катетер в рог матки, а от того, насколько правильно выполнено введение. 

Однако на этот счет имеется и другая точка зрения , что конструкция приборов существенно  не влияет на результаты извлечения и пересадки эмбрионов. Эти результаты более связаны с типом гонадотропина, квалификацией оператора, качеством и стадией развития эмбрионов.(4) 

В целом же следует  отметить, что нехирургический метод  пересадки эмбрионов обеспечивает аппликацию зародышей в среднем 50-60%, а применение маточных релаксантов перед пересадкой- до 75%. Это существенно выше, чем при хирургическом методе. Технология нехирургического метода трансплантации сходна с искусственным осеменением коров и продолжается 3-5 минут, или 15-20 пересадок в час.  

Особого внимания заслуживает приём Sertich P.L, заключающийся  в нехирургической пересадке  двух эмбрионов, по одному в каждый рог матки, что еще больше повышает эффективность трансплантации. Этот приём может быть применен для повышения частоты рождения разнояйцевых (дизиготных) двоен. Он позволяет получить двойные отелы у коров, особенно мясных пород, намного быстрее, чем генетическим путем (т.е. селекцией).(5) 

Результаты проведенных  исследований показывают, что нехирургическая пересадка дополнительного эмбриона во второй рог матки дает возможность увеличить выход новорожденных телят на 30%. При пересадке двух эмбрионов в каждый рог матки частота двоен составляет в среднем 55-60%, вместо 2% при естественном многоплодии коров. 

Можно пересаживать (подсаживать) эмбрион и оплодотворенной  корове, но в контрлатеральный по отношению  к желтому телу в яичнике рог  матки. Средняя приживляемость эмбриона осемененной корове при нехирургической  подсадке составляет 50%.(Таблица 3)(4)  

Обобщая результаты экспериментов по нехирургическому методу пересадки эмбрионов, можно  прийти к заключению, что пересадка  двух эмбрионов в два рога матки  реципиента или подсадка одного предварительно осемененному реципиенту в контрлатеральный рог матки являются эффективными и перспективными методами в биотехнологии трансплантации эмбрионов.(1)  

Криоконсервация эмбрионов. 

Эффективность трансплантации эмбрионов крупного рогатого скота во многом определяется условиями хранения зигот. Самым  эффективным и перспективным методом консервации эмбрионов является их глубокое замораживание (криоконсервация) в жидком азоте при температуре -196 градусов. Разработка метода долговременного хранения криоконсервированных эмбрионов значительно расширяет возможности трансплантации. Только в этом случае она может быть надежной биотехнологической основой селекционной программы. 

Долговременное  хранение глубокозамороженных эмбрионов  имеет ряд преимуществ. Отпадает необходимость в содержании больших  стад или групп реципиентов, так как пересадки могут быть проведены в любое время независимо от сроков взятия эмбрионов от доноров, что существенно повышает рентабельность трансплантации. Кроме того, криоконсервация эмбрионов позвозяет создавать эмбриобанки от генетически ценных животных, а также сохранять генофонд редких и исчезающих пород и транспортировать эмбрионы в любые страны мира. По оценке специалистов криоконсервация эмбрионов экономически оправдана, она исключает генетический дрейф, т.е. изменение частоты генов в популяции, вызванные случайными причинами. 

         При соблюдении правильной биотехнологии  выживаемость эмбрионов составляет 90%, а стельность коров-реципиентов  после нехирургической пересадки  находится в пределах 50-55%. Однако  нередко в производственных условиях при несоблюдении технологии замораживания-размораживания выживаемость эмбрионов уменьшается, что существенно снижает рентабельность криоконсервации. Обосновано, что использование метода криоконсервации эмбрионов в производственных условиях является рентабельным только в том случае, если выживаемость эмбрионов после размораживания будет не менее 80%, а процент стельности коров-реципиентов составит 55-60%. 

По принятой в России технологии, эмбрионы замораживают с применением автоматических устройств, обеспечивающих регулирование скорости охлаждения в заданных режимах. Эмбрионы замораживают в пробирках 50x6 мм или в ампулах вместимостью 1 мл. В пробирку или ампулу вносят 1-4 эмбриона от одного донора и 0.4 мл раствора криопротектора (1.5 М ДМСО или 10%-ный раствор глицерина). Ампулы перед замораживанием запаивают на пламени газовой горелки. Ампулы или пробирки маркируют, затем охлаждают с 20 до -6 градусов со скоростью 1 градус в минуту, проводят кристаллизацию, охлаждение со скоростью 0.3 градуса в минуту и погружают в жидкий азот. Применяется также и другой режим: охлаждение от -7 до -35 градусов со скоростью 0.3 градуса в минуту; от -35 до -38 градусов со скоростью 0.1 градус в минуту и погружение в жидкий азот. Оттаивание эмбрионов производится на водяной бане с температурой 25 или 37 градусов в течение 10-12 секунд. Для хранения и транспортировки замороженных эмбрионов используют сосуды Дьюара различных типов. 

Практика криоконсервации  эмбрионов крупного рогатого скота  свидетельствует о том, что на выживаемость эмбрионов существенное влияние оказывает не только технология глубокого замораживания и оттаивания, но и их качество и стадия развития. Для успешной криоконсервации следует отбирать эмбрионы без морфологических нарушений, находящиеся на стадиях поздней морулы или ранней бластоцисты. 

Необходимость отбора эмбрионов диктуется еще  и тем обстоятельством, что у 10% из них обнаруживается неправильное развитие, а при криоконсервации  повреждаются в среднем еще 25% клеток бластоцисты. Такие эмбрионы испытывают большую редукцию интактных бластомеров, вследствие чего преживаемость и дальнейшее развитие после замораживания и оттаивания существенно нарушаются. 

Таким образом, соблюдение правильной биотехнологии  криоконсервации и пересадки  эмбрионов позволит обеспечить стельность реципиентов на том же уровне, что и при пересадке свежеполученных эмбрионов. Вместе с тем метод криоконсервации в будущем может быть существенно упрощен, или вообще можно будет отказаться от удаления криопротектора и пересаживать эмбрионы реципиентам непосредственно после оттаивания без дальнейших манипуляций. По прогнозу специалистов, криоконсервированные эмбрионы могут храниться десятки и сотни лет.(2)