Электрохроматографическое определение токсикантов в сточных водах

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

Рисунок 3.2. Различные варианты конструкции аппаратов для электрофореза на бумаге (по Троицкому). 

А - разные формы приборов; Б – разные способы крепления бумаги:1,2 – свободная подвеска; 3 – на опорах в виде выступающих острий; 4 – на нитях;

10,11 – крепление  с помощью пружинных  оттяжек; 15 – расположение нескольких полосок с одним буферным сосудом; 18 – с помощью груза, подвешенного по концам бумаги. В – приборы с испарением: 5 – большая

камера; 6 –  крышка с пористой прикладкой; 7 - прибор для реофореза по Машбефу. Г – приборы с исключенным испарением. Д – приборы с уменьшенным испарением: 19 – малая камера; 20 – над электрофоретической

полоской  натянута влажная занавеска из фильтровальной бумаги; 21 – картонный «шнур», заключенный в стеклянную трубку; 22 – прибор с охлаждением. Буквами обозначены: б – бумага; н – нити; и – пористая прокладка; с – электродные сосуды; п – пружинные оттяжки; р – неполярный растворитель; м – металлические или пластмассовые пластины; а – охлаждающая спираль; к – крышка; э – электрод; г – груз.

Отчетливое  разделение зон низкомолекулярных  веществ в электрических полях  напряженностью 10-20 в·см^-1 привело к развитию высоковольтного электрофореза, при котором Е достигает 100 в·см^-1 и выше.

 

 

 

 

 

 

 

Рисунок 3.3. Схема для высоковольтного электрофореза (по Михлю): 1 – бумажная полоска для электрического контакта; 2 – целлофан; 3 – полоска бумаги со смесью разделяемых ионов; 4 – охлаждаемые водой камеры.

Одной  из основных трудностей, которые имеют  место при приложении столь больших  напряжений к бумаге, является выделение  большого количества тепла. Это приводит к быстрому испарению буфера из полосок  бумаги и соответственно к искривлению  зон, что затрудняет интерпретацию  получаемых электрофореограмм.

Что  касается современных тенденций  в использовании электрофореза  на бумаге, то они связаны с определением природы химических и физических связей, изучением сыворотки крови  и других биологических жидкостей, диагностикой ряда патологических состояний, химико-токсикологическим анализом.

Электрофорез  на ацетатной целлюлозе широко распространен для изучения растворов протеинов. В отличие от фильтровальной бумаги, которая состоит из различимых целлюлозных нитей, мембрана из ацетатной целлюлозы является тонкой, микропористой, однородной по структуре и проявляет, вероятно, минимальные адсорбционные свойства.

 

 

 

 

 

 

 

Рисунок 3.4. Схема камеры для электрофореза на мембранах из ацетата целлюлозы: 1 – крышка камеры с прокладкой; 2 – электродные кюветы; 3 – мембрана; 4 – бумажные мостики.

Тонкослойный  электрофорез. В дополнении к хорошо известным в хроматографии применениям, тонкие слои глинозема, кремнезема, кизельгура успешно используются как стабилизирующая среда в зональном электрофорезе, в частности, для разделения низкомолекулярных веществ. Применение тонкослойного материала имеет следующие преимущества по сравнению с методикой электрофореза на бумаге: 1) разделение веществ значительно лучше; 2) время разделения составляет примерно около 3 часа при градиенте потенциала 25 в/см; 3) результаты легче поддаются количественной оценке; 4) методика работы более простая; 5) при объединении методик электрофоретического и хроматографического разделений появляется возможность получить лучшее разделение за более короткое время.

 

 

 

 

 

 

 

 

Рисунок 3.5. Схема аппарата для тонкослойного электрофореза.

Тонкий  слой пористого наполнителя 1 равномерно наносят в сухом состоянии на стеклянную пластину 2, которую помещают на металлическую поверхность 3, интенсивно охлаждаемую снизу водой от термостата или водопровода. Контакт порошка с электролитом осуществляется с помощью полосок толстой фильтровальной бумаги 5. При этом порошок равномерно насыщается электролитом вследствие капиллярных явлений. Исследуемую пробу наносят на заранее отмеченное место и включают ток. В случае разделения весовых количеств (порядка нескольких миллиграммов)  пробу необходимо вносить в сухой слой порошка на равном расстоянии от электродных сосудов. При движении электролита к центру проба располагается в виде узкой зоны по ширине слоя. Для уменьшения испарения раствора в процессе электрофореза стеклянную пластину накрывают пластмассовой крышкой 4, образующей влажную камеру. Одним из преимуществ тонкослойного электрофореза является легкость регенерации порошка и хорошая воспроизводимость условий и результатов экспериментов.

Непрерывный зональный электрофорез эффективнее, чем прерывные процессы при необходимости получить препаративное разделение многокомпонентных смесей. Важным преимуществом такой техники является возможность автоматизировать выход разделенных фракций в отдельные приемники. Основой является течение раствора электролита в направлении, перпендикулярном направлению электрического поля. При этом, естественно, имеет место непрерывное разделение. Компоненты смеси отклоняются в различных направлениях в соответствии с их электрофоретическими подвижностями, после прохождения некоторого расстояния они могут непрерывно собираться в разных местах коллектора. Угол разделения различных соединений в простейшем виде зависит от скорости течения буферного раствора и электрофоретической подвижности.

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

Рисунок 3.6. Непрерывное электрофоретическое разделение: 1 – вещество; 2 – буферный раствор.

 

3.3.Электрофорез на бумаге.

Разделение  анализируемой смеси происходит на определенных сортах хроматографической бумаги, пропитанной буферным раствором, в приборах для электрофореза. Белки разделяют при напряжении до 500 В. Схема одного из вариантов приборов для низковольтного электрофореза представлена на рисунке 3.7.

Рисунок 3.7. Схема прибора для низковольтного электрофореза на бумаге

Камера  для электрофореза состоит из плексигласовой ванны с пригнанной к ней крышкой (1). В ванне имеются 2 электродных отсека (2), каждый из которых разделен продольной перегородкой (3) на два отделения, сообщающиеся между собой. Во внутренние отделения отсеков опускают электроды, а во внешние — концы бумажных полос (4), основную часть которых располагают на горизонтальной пластинке с шипами (5), находящейся в центральной части камеры. Между горизонтальной пластинкой и наружным отделением электродных отсеков имеются палочки (5), через которые перекидываются бумажные полоски и которые служат для их поддерживания. Под верхней крышкой камеры находится сделанная из плексигласа пластинка с большими круглыми отверстиями (7), на которую сверху кладутся смоченные в дистиллированной воде, сложенные  в 4-5 раз листы фильтровальной бумаги. Эти листы способствуют увеличению герметичности камеры и как следствие - уменьшению испарения жидкости с электрофореграмм в процессе электрофореза.

Электрофорез  на бумаге осуществляется на листах (полосках) хроматографической или фильтровальной бумаги, концы которой опущены в электродные камеры. Разделяемая смесь наносится на бумагу в виде пятна либо узкой зоны. По способу отведения теплоты, выделяющейся при прохождении через бумагу электрического тока, используют приборы: с охлаждающими пластинами из изолирующих материалов; с охлаждающей несмешивающейся с водой орг. жидкостью, например керосином; с естественным охлаждением бумаги на воздухе или во влажной камере.

Рисунок 3.8. Схема прибора для электрофореза на бумаге: 1 - буферный электролит; 2 - электроды; 3 - кювета с охлаждающей орг. жидкостью; 4 - полоска хроматографической бумаги; 5 - электролитический мостик; 6 - водяная рубашка.

 

3.4. Хроматографическая бумага

Хроматографической бумагой называют целлюлозную фильтровальную бумагу, отличающуюся особой чистотой и некоторыми особыми свойствами, а также другие типы бумаги, например бумагу из модифицированной целлюлозы, стекловолокна и т. п. Материалом для изготовления нормальной хроматографической бумаги должна служить возможно более чистая целлюлоза. Обычно для этой цели используют коротковолокнистую целлюлозу, называемую линтером, которая содержит приблизительно 98—99% α-целлюлозы, 0,3—1,0% β-целлюлозы и 0,4—0,8% пентозанов. В пригодной для употребления бумаге иногда имеются примеси, например следы аминокислот, неорганических солей и липофильных веществ (смол и др.). В большинстве случаев эти примеси не мешают хроматографированию, если же они могут повредить, то их надо извлечь из бумаги, промывая ее последовательно разбавленной соляной кислотой, водой или метанолом, ацетоном и т. п., или же использовать имеющуюся в продаже специальную хроматографическую бумагу. Другая важная особенность хроматографической бумаги состоит в следующем: нанесенная на нее жидкость перемещается под действием капиллярных сил по капиллярам, образованным волокнами бумаги.

Таблица 3.1.

Характеристика  наиболее употребительных марок  хроматографической бумаги

Марка бумаги	Удельная масса, г/м3	Толщина, мм	Длительность капиллярного подъема  воды на высоту 30 см, мин	Зольность, %	Элюирование на 35 см в системе Партриджа	Характеристика применения
Ватман №1	85—89	0,16	140—220	0,06-0,07	15—16	Стандартная
№3 ММ	180	0,31	140—180	0,06-0,07	11	Препаративная
№4	90-95	0,19	70-100	0,06-0,07	9	Быстродействующая
№31ЕТ	190	0,50	60-120	0,025	4	Весьма быстродей ствующая
№54	90-95	0,17	60—120	0,025	6	Промытая, быстродействующая
Шляйхер- шюлль 2040а	85-90	0,18	90-140	0,04—0,07	7	Быстродействующая
2043b (GG1)	120—125	0,23	220—260	0,04-0,07	15	Стандартная
2045b (G1)	120-125	0,16	300-400	0,01—0,07	45	Медленнодействующая
2071	600-700	0,67	276—290		23	Препаративная

Количественно эта характеристика бумаги определяется скоростью, с которой растворитель проникает в капилляры, и конечной высотой подъема. Эти характеристики капиллярного подъема зависят от плотности и от густоты сетки волокон бумаги. Чем плотнее бумага (а значит, чем она глаже, менее проницаема и менее прозрачна), тем ниже характеристики капиллярного подъема. Чем волокна рыхлее, тем больше высота подъема. На практике наилучшими оказались сорта бумаги, выпускаемые фирмами Whatman (Балстон, Англия), Schleicher und Schull, Macherey-Nagel и Ederol (ФРГ), а также бумага марки «Фильтрак» (ГДР) и «Ленинградская бумага» (СССР). Чаще всего пользуются так называемой стандартной бумагой (табл. 3.1). Одна из самых лучших марок — бумага ватман № 4, которая по чистоте и разрешающей способности приближается к ватману № 1, но более плотна, благодаря чему на нее можно наносить большие количества вещества, а также более эффективно проводить обнаружение. Разделение на этой бумаге идет быстрее, чем на бумаге других марок. Для препаративных целей пригодны также и другие марки толстой бумаги. Сводка характеристик наиболее широко применяемых марок хроматографической бумаги приведена в табл. 3.1. Бумага из модифицированной целлюлозы применяется все реже. Выпускаются специальные сорта бумаги с повышенным содержанием карбоксильных групп , служащие для разделения катионов, например протонированных аминов и аминокислот, но для этого чаще применяются бумаги, пропитанные ионообменниками (например, сильнокислотным ионообменником амберлит SA-2, махерей-нагель или слабокислотным ионообменником амберлит WA-2), или бумаги, изготовленные из химически обработанной целлюлозы («ионообменной целлюлозы»), в частности из карбоксиметилцеллюлозы (ватман СМ-82), DEAE- целлюлозы (ватман DE-81), ЕСТЕОLA-целлюлозы (ватман ЕТ-81), фосфатцеллюлозы (ватман Р-81) и др.

Один  из наиболее ранних способов модифицирования  хроматографической бумаги — ее ацетилирование . Этим способом получены марки ацетилированной бумаги (например, шляйхер-шюлль 2043б/6, 2043б/21, 2043б/45 и махерей-нагель. 213Ас, 261 Ас и 263Ас), различающиеся по содержанию ацетильных остатков. Эти марки бумаги используются для обращеннофазной хроматографии липофильных веществ. Позднее было обнаружено, что они вполне пригодны для разделения рацеми- ческих смесей, потому что сама ацетилцеллюлоза является хи- ральным веществом и вследствие этого оптические антиподы перемещаются по ней при хроматографировании с различными скоростями. Для гидрофобизации бумаги применяют также пропитку силиконами, которые затем служат носителями липофильной неподвижной фазы (пропитанная силиконовым маслом бумага—ватман № 1, 4 и 20, шляйхер-шюлль 2043hy; махерей-нагель 202WAA, 261WAA и 263WAA); имеются и другие пропитывающие агенты (каучук, жидкие ионообменники и др.), но только некоторые из них нашли применение в крупносерийном масштабе. Известны также марки бумаги, пропитанной адсорбентами, например оксидом алюминия (ватман TAL/A или шляйхер-шюлль 288), силикагелем (ватман SG81 или шляйхер-шюлль 289) или карбонатом кальция (шляйхер-шюлль 290).